2015版中国药典微生物检验

2015版中国药典微生物检验2015版微生物检验•实现了三部药典标准的统一•形成了一个比较完备的药品微生物检验标准体系，具有以下两个显著特征•①全面与国际标准接轨；•②推动了药品微生物控制由终产品检验向过程控制转变。2015版微生物检验•微生物基础知识•非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)解析•非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(通则1106)解析•非无菌药品微生物限度标准(通则1107)解析•培养基的质量管理•工艺用水的检查•无菌检查法(通则1101)解析微生物基本知识•定义：微生物（microorganism）是对所有形体微小，单细胞或结构较为简单的多细胞甚至无细胞结构的低等生物的统称。微生物的分类•原核微生物：细菌、放线菌、立克次氏体支原体、衣原体、蓝细菌和古细菌•真核微生物：酵母菌、霉菌、粘菌、原生动物和藻类•非细胞型生物：病毒、噬菌体、类病毒、拟病毒和朊病毒微生物特点•体积小，比表面积大•吸收多，转化快•生长旺，繁殖快•适应强，易变异•种类多，分布广球菌杆菌•杆菌螺旋菌革兰氏阳性细菌与阴性细菌细胞壁构造图菌落菌落(colony)：将单一微生物细胞或一小堆同种微生物细胞接种到固体培养基表面，当它占有一定空间并给予适宜的培养条件，该细胞就会迅速生长繁殖。结果形成以母细胞为中心，肉眼可见并有一定形态构造的子细胞集团。真核微生物形态•真核微生物：是细胞核具有核膜、核仁，能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等多种细胞器的一类微生物。酵母菌特性①个体一般以单细胞状态存在②多数为出芽繁殖，也有裂殖；③能发酵糖类产能；④细胞壁常含甘露聚糖；⑤喜在含糖量较高、偏酸性环境生长。酵母菌菌落特征与细菌相似，较细菌大而厚，圆形，光滑湿润，粘性，易用针挑起，颜色单调，多为乳白色、少数红色、常有酒香味霉菌特性丝状真菌的一个通俗名称，意即“发霉的真菌”。霉菌的营养体由菌丝构成，菌丝无限生长并产生分枝，分枝的菌丝相互交错在一起，形成菌丝体。霉菌菌落特征•霉菌细胞呈丝状，在固体培养基上形成营养菌丝和气生菌丝。霉菌菌落较酵母菌大质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或蛛网状、绒毛状或棉絮状。菌落与培养基连接紧密，不易挑取，常有霉味。非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)解析•格式变化•内容变化•通用要求变化—适用范围—检测环境变化—培养基—计数的方法—菌种及菌液制备—培养基适用性检查—计数方法适用性试验—供试品检查格式变化•2010版附录ⅩⅢC/附录XIJ：微生物限度检查法•2015版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）•非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）•非无菌药品微生物限度标准（通则1107）中国药典2010年版微生物计数法编排方式中国药典2015年版微生物计数法编排方式格式变化内容变化适用范围•微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。•明确规定本法不适用于活菌制剂的检查。•增加了检测产品的范围。2010版：系检查非规定灭菌制剂及其原料辅料受微生物污染程度的方法检测环境变化•微生物计数试验环境要求微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防治污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流区域、工作台面及环境应定期进行监测。•9203：药品微生物实验室质量管理指导原则“微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行”。试剂和试药•中和剂、灭活剂和表面活性剂均应对微生物无毒性其相互间具有相容性，有利于样品中微生物均匀分散。•稀释液1、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液；2、pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液；如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。3、0.9%无菌氯化钠溶液。培养基•对照培养基按标准物质管理，由中检院负责研制分发。•计数用培养基a.需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）b.霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）玫瑰红钠琼脂培养基或含抗生素的SDA。计数的方法•1.平皿法：包括倾注法和涂布法。该项下明确可使用直径较大平皿，且培养基的用量应相应增加。•2.薄膜过滤法。•3.最可能数法(Most-Probable-NumberMethod，简称MPN。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。•注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择。培养基适用性检查•胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉•胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌•沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂、白色念珠菌、黑曲霉。计数方法适用性试验•1.术语变化：计数方法适用性试验•2.需氧菌总数测定用五种菌株试验•3.菌液加入方式：菌液加入供试液中，使每1mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu，且所加菌液的体积不超过供试液体积的1％。供试品分类及供试液制备•1.水溶性供试品•2.水不溶性非油脂类供试品•3.油脂类供试品试品：•4.需用特殊方法制备供试液的供试品：①膜剂、②肠溶及结肠溶制剂、③气雾剂喷雾剂、④贴膏剂检验量•一般随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。•除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重或微量包装药品的检验量可以酌减。•检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。培养条件•描述方式：按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定。•培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种，所有试验管在30～35℃培养3～5天。菌数报告规则•1、平皿法：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm供试品中所含的微生物数。取两位有效数字报告。•如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。菌数报告规则•2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告规则以相当于1g、1ml或10cm供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm供试品），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。•3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。计数要求•需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数)；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数)。•若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氯霉素、庆大霉素)的沙氏葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基(如玫瑰红钠琼脂培养基)进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。•若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。计数标准•参考欧、美药典，增加菌落计数标准规定结果以10ncfu表示时，限度标准解释如下：“101CFU：最大可接受限值=20；102CFU：最大可接受限值=200；103CFU：最大可接受限值=2000。•若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合各品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合各品种项下的规定，判供试品不符合规定。计数标准•例如，当标准为101cfu，不同于以往10cfu规定。以10的指数规定标准，考虑了微生物计数结果的可变性，即计数结果非类似化学检验结果。故要求我们需要在结果判断时或制定内控标准时，对于结果的判断或历史数据的分析需要用风险分析的手段进行评估。制定标准时需要依据历史数据、工艺过程、用药人群等进行相应分析，制定合理的内控标准，即总原则为在内控标准的控制下产品无任何质量风险。总结：检验程序•1、培养基适用性检查；•2、方法适用试验前评估；•3、通过评估，采用规定的稀释液制备样品•4、试验组、菌液对照组、供试品对照组、中和剂或灭活剂对照组（需要的话）制备；培养、观察、计数；计算回收率；•5、判断回收率结果是否满足要求：•⑴是，方法适用性试验通过，进行确认；•⑵否，重新选择方法进行适用性试验。•6、按通过的方法进行样品检验。2015控制菌检查主要变化—培养体系•增菌培养基（广谱增菌培养基替代选择性增菌培养基）、预增菌、选择性增菌、分离用培养基种类变化；培养时间与温度变化。•培养基的适用性发生变化。•方法适用性发生变化（方法适用性）。•强抑菌性样品的处理方式发生变化。耐胆盐革兰阴性菌•耐胆盐革兰阴性菌(Bile-TolerantGram-NegativeBacteria)替代2010年版大肠菌群Coliform）•耐胆盐革兰阴性菌为一群无严格定义的微生物，通常它们被定义为能够在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上生长的微生物。它们包括无乳糖发酵但能够利用葡萄糖，能够在胆盐中生长的革兰阴性菌，例如，肠杆菌科、假单胞菌和气单胞菌属的一些胆盐耐受的革兰阴性菌。控制菌检查方法适用性结果判断方式•Ch.P2015：如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。（阳性对照可以不生长）非无菌药品微生物限度标准(通则1107)解析•修订思路（1）将《中国药典》2010版一、二、三部微生物限度标准项目进行对比、整合。•采用一部的限度标准项目作为合并后限度标准的基础。•参考EP7.0、USP35、JPⅩⅤ标准，修订中国药典的微生物限度标准。•采用清晰直观的表格形式，按给药途径、分液体、固体性状、列出各类药品的限度标准。与欧洲药典8.0、美国药典36版和日本药局方ⅩⅤ比较，修订中国药典的微生物限度标准。•修订菌数标准表述方式：指数形式10n，最大可接受限度值遵守2倍规则：101CFU：最大可接受限度为20；102CFU：最大可接受限度为200；依此类推。•修订检查项目：“需氧菌总数（TAMC）”替代“细菌数”“耐胆盐革兰阴性菌”替代“大肠菌群”2015版限度标准的制定特点及总体结构•增订检查制剂类型：基于药品的给药途径及对患者的潜在危害划分风险等级来制定标准。齿龈、皮肤制剂、呼吸道制剂；增加原辅料、中药提取物、中药饮片的控制•兼顾国产药品的特点，保留中国药典对中药制剂分类特点：是否含药材原粉，是否含豆豉、神曲；是否接触完整皮肤黏膜。非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂•1.口服给药制剂（固体、液体）•2.口腔黏膜给药制剂、齿龈给药制剂、鼻用制剂•3.耳用、皮肤给药制剂•4.呼吸道吸入给药制剂•5.阴道、尿道给药制剂•6.直肠给药制剂（固体、液体）•7.其他局部给药制剂非无菌含药材原粉的中药制剂•1.固体口服给药制剂（含/不含豆豉、神曲等发酵原粉）•2.液体口服给药制剂（含/不含豆豉、神曲等发酵原粉）•3.固体局部给药制剂（用于表皮或粘膜完整/不完整）•4.固体局部给药制剂（用于表皮或粘膜完整/不完整）2015版各项标准具体规定非无菌含药材原粉的中药制剂非无菌的药用原料及辅料中药提取物及中药饮片菌数结果报告•1、当菌落数在100以内时，按实有数据报告。•2、菌落数大于100时，取两位有效数字报告•(1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中平皿法菌数报告规则中提及)。•3、当菌数报告数表示为“…×10n”时，是实际数值，与标准规定项下指数形式表述、2倍因子控制不同。执行及制定药品微生物限度标准注意事项执行范围：•--生产、贮存、