氨基酸的薄层层析生化实验报告

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：2013级临床医学（妇幼医学）组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸的薄层层析实验日期2014-10-13实验地点第二实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期（一）实验目的利用薄层层析法测定混合氨基酸中各分离斑点的Rf值，以分离和鉴别混合氨基酸的成分。（二）实验原理①薄层层析法分离氨基酸：由于吸附剂（本实验采用硅胶）对各种氨基酸的吸附能力不一样，而且不同氨基酸在展开剂中的溶解速度以及在薄板上移动速度也不相同，所以利用此法可将不同种类的氨基酸吸附在薄板的不同位置上，达到分离的效果。②氨基酸的显色反应：茚三酮水化后可与氨基酸发生显色反应，使氨基酸斑点呈现紫色，使我们可以测定氨基酸Rf值。③通过所测得混合氨基酸各成分的Rf值与单种氨基酸Rf值的对比来鉴别混合氨基酸的成分。（三）实验材料实验样品：①丙氨酸②精氨酸③甘氨酸④混合氨基酸主要试剂：①硅胶粉②0.5％的羧甲基纤维素钠③展层-显色剂仪器及器材：天平、小烧杯、小勺子、移液管、玻璃板、铅笔、尺子（四）实验步骤：实验流程图操作步骤①用天平称取3.0g硅胶于小烧杯中，另用移液管取8ml0.5％的羧甲基纤维素钠与硅胶混合，搅拌均匀成糊状。②把做好的糊状物均匀涂在一块干净的玻璃板上，晾干备用。③取另一块已经做好的展板，在距其底边2cm处的水平线上均匀确定4个点并用铅笔标记。用毛细吸管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸依次点在4个点上。④待样品干了之后就放进展层-显色液中进行层析分离氨基酸。⑤待层析液上升到超过展板长度三分之二时取出，用铅笔画出溶剂前缘后交由老师统一帮我们烘干。⑥烘干后取回展板，测定各斑点中心到样品原点中心的距离（a）以及溶剂前缘至样品原点中心的距离（h）。硅胶0.5％的羧甲基纤维素钠搅匀，制作展板吸取样品在展板上点样放进展层-显色液中层析取出烘干测定Rf值⑦数据记录、计算Rf=a／h×100％测定次数各氨基酸斑点中心至原点中心的距离（a）丙氨酸精氨酸甘氨酸混合点1混合点2混合点3123平均a值溶剂前缘至样品原点中心距离（h）Rf值注意事项：①点样斑点直径大小要控制在一定范围内，一般来说样品斑点直径不应超过2mm，否则易造成相互交叉或拖尾。②点样时要多次重复点样，避免出现由于样品量过少，层析效果不明显的状况；另外点样时应等第一点样品干了之后才进行二次点样以防止样品原点直径过大。②层析时间不能过长，以保证氨基酸斑点在展板内。③避免污染，整个过程中避免用手接触层析板以免影响实验结果。（五）实验记录与结果讨论：实验记录：①在称取硅胶过程中不小心外洒了一些，导致实验所用硅胶量偏小。②展板质量不错，很平整，厚度较均一。③丙氨酸处出现两个斑点。较低位的斑点中心到原点中心的距离为3.00测定次数各氨基酸斑点中心至原点中心的距离（a）丙氨酸精氨酸甘氨酸混合点1混合点2混合点313.582.002.853.552.901.8523.611.952.903.582.881.9033.581.972.873.562.901.87平均a值溶剂前缘至样品原点中心距离（h）3.591.972.873.562.891.876.906.906.886.906.906.90Rf值0.5200.2860.4170.5160.4190.271结果讨论：①丙氨酸处出现两个斑点，可能是因为该样品被污染，因为同一实验室中有好几组都出现了相同的状况。②因为只有精氨酸的斑点出现了拖尾现象，所以排除了硅胶颗粒太小以及层析液因为挥发浓度降低引起的可能。最可能的原因是在点样时该样品原点直径过大，样品不能很好地分离；③单种氨基酸的Rf值与混合氨基酸成分的Rf值相差不大，从中可知道混合氨基酸中的成分有丙氨酸、精氨酸和甘氨酸。