芽孢生成和萌发相关机制

2016:年第2卷第11__中茜萬:绪合护雜(中英文)NursingofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine.169•芽孢生成和萌发相关机制徐智勇\闫岩2,王卫2,周平乐2,高小坤3(1.扛参省凝州市妇翁保健院.江葬扬州，.225001.;2.,_省南顧緣顧_有限公司扛苏肅氣細36;3.嫌省麵人藤衡扬州，225001)关键词：芽雜*寶体；萌发!.、鸾&厲中图分类号：R33文献标志码：A文章编号：2096-0867(2016)11-0169-04DQI:10.119.9.7/ttitcwm.201611064:芽孢(endospore)又称_内生:孢子5是细菌休眠体。常见的产芽孢细菌主要为芽孢杆菌.属（Ba­cillus)、梭状芽抱杆菌属(.Clostridium)、芽抱乳酸懷:属:(_Sporolaetobacilbs)等。产芽孢细菌在营养条件缺乏时,在细胞内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能绖受高温、紫外线、，电离辐射以及多种化学物质灭杀等，在灭蘭监测中，可利用芽孢的高抗逆性制备生物指示剤。生物指示剂可甩于监测灭菌过程对微生物的杀灭力度,是消毒中心常用监测指示剂。本文具体阐述了芽孢的结构、萌发和生成机制。1芽孢结构细菌養养菌体的结构主要有细胞壁、细胞膜、细胞质和核里组成。芽孢的结构与营养菌体有显著差异,为同心売层形式的多层结构，芽孢的独特结构是其具有商抗逆性的前提。穿孢结构由外到内依次为芽孢衣、皮层和核心，在某些特殊种属的象孢中,,芽抱衣外班翁一M■松散泡状结构的芽孢外壁_。芽孢结构如图1所示。图1芽孢结构l.i芽孢衣芽孢衣覆蒹在芽孢外膜上，由多种蛋a质组成。芽孢衣中蛋白质由母细胞合成，转运至芽孢表面。芽抱衣中的芽孢特异性蛋白质，可保护芽收稿日期:2_016_-10-12通信作者:高小坤，E-mail:[e-mail]孢不受活性化学物质、瘠菌酶等的损伤tl]e研究[2_5]证明，芽孢衣可保护芽孢免受戊二醛、碘和氧化剂等化学物质的灭杀作用，而去除芽孢衣的枯草芽孢杆菌芽孢则对溶菌酶高度敏感。1.2皮层芽孢皮层较厚，i要由肽聚糖组成，可达芽孢总千重的10%,皮层的肽聚糖同营养菌体细胞壁的肽聚糖相似，怛结构相对松散，对维持芽孢抗性和休眠状态极为重要g由于皮崖肽聚糖中的一部分N-乙酰胞壁酸的氨.基酸残基被短肽取代，导致皮层肽聚糖的交联度比营养菌体细胞壁中肽聚糖的交联度低，皮层中每两个胞壁酸被取代成为胞壁内酰胺（MAL)[6-\,MAL是皮层溶解酶的识别元件，在芽孢萌发过程中受溶解酶作用可水解皮层，却不会水解芽孢壁[^31.3核心层核心层位于芽孢最内部，包括芽孢壁，内膜层和核芽袍壁由肽聚糠组成，同营养细胞细胞壁的结构基本相同s，内膜层位于芽孢壁内层，具有极低的透过性，小分子物质极难透过，可阻挡DNA损伤物质透过内膜层对芽孢内核DNA造成损伤。核区含有芽孢DNA、RNA和大多数酶，含水量极低，约为芽孢湿重的25%~50%。吡啶二羧酸(DPA)，在核区.与Ca2+聱合，以钙盐CaDPA的形式存在，在核心区含量较高，约占核心|重柄25%，其可促进芽孢核心脱水，增加芽孢的热抗■性*小酸溶性芽抱蛋•(_SA_SR〇同p孢核心DNA紧密结合•可使芽孢耐受辐射、于燥、高温等破坏，在芽抱萌发时则可作为碳源和能源[))]。2芽孢的生成可产芽袍菌体可进行两种形式的繁殖，在外•170•中西医结會护理（中英文:)第2卷界环境适意,营养充足条件下为营养菌体繁殖，若'外界环境恶劣或营养物质缺乏则成为芽抱，在一定条件下、芽孢可萌发成为营养菌体进行繁殖。芽孢生成过程主要包括以下3个步骤:①不对称分裂;②裹吞作用;③#细胞裂解，如图2所示。图2芽孢生成循环过程2.1不对称分裂.DNA结合蛋白SP〇0A是细胞从营养生长期进人芽孢形成时期的关键应答调节蛋白，磷酸化的SP〇0A是其活性形式。芽抱生成主要是由细胞内外环境来决定，有利带芽孢生成的外界环境_可诱导SpoOA的磷酸化，着磷酸化SpoOA在胞内达到一定的_值时，通过调控一系列芽孢生成相关基面启动芽孢生成。芽孢生成相关基因包括不对称分裂相关基因、RNA聚合酶CT困予等。（T因子为RNA聚合酶核心酶之外的单独组分，崖正确识别转录过程中启动子的关键因子•,不同的(T因子可组成不同的RNA聚合酶全酶,.识别.不词的动fw在基因调节作用下，营养菌体胞质的非对称分裂，中间电隔膜分隔，生成一个母细胞和前芽孢。母细胞是芽孢生成所必需，但母细胞最终会进入程序性凋亡被水解，前芽孢则最终生成成熟芽孢。不对称分裂及其后期生成的母细胞和前芽孢表达不同鮮〇■礙子y母细胞中._达_〇^_菌子，前芽孢中表达crF因子[12]，而磷酸化SpoOA则可诱导crE与crF因子的活化2.2裹呑作用母细胞通过吞噬的形式，将前芽孢吞弁，吞并后，前芽孢位于母细胞细胞质内。经裏吞机制作用,母细胞和前芽孢中分别表达crk与crG，通过诱导激活发挥各自功能，促进成熟芽孢的生成。2.3母细胞裂解裹吞作用结束后，芽孢壁、皮层及芽孢衣等芽孢特有结构逐步合成。皮层由肽聚糖组成，位子芽孢内膜和外膜之间，芽孢肽聚糖前体蛋貪在母细胞中合成，从前芽孢孙膜转人内膜形成皮层。芽孢最外层的蛋ft外衣，在母细胞中生成,由至少70种单独的蛋ft质组成，经吞并覆盖在前芽孢的外表面@]。母细胞中大量合成的DPA，被摄取进人前芽孢，导致前芽孢内核水分含量急剧下降，母细胞裂解.成熟芽孢生成。霍振华^]通过扫描电镜观察了芽孢形成过程中的结构变化，芽孢衣形成后，母细胞细胞质逐步被降解，成熟芽孢则被释放出来。3芽孢萌发芽孢虽处于休眠状态,但仍在监测外界环境状况。虐外界环境适宣芽孢生长，尤其是营养充足时，芽孢萌发、生长，恢复繁殖。芽孢萌发是指一系列连续事件1使芽孢抗性逐步丢失，恢复营养菌体繁殖生长的过程。萌发过程，无需新合成大分子蛋白质、酶或其他一些相关物质，而是利用成熟芽孢本身存在的物质。3.1芽孢萌发过程芽孢萌发生长通常是由营养性萌发剂所引发，費养性萌发剂具有种属特异性，不同营养性萌发剂对不同种属的芽孢作用不同@常见的营养性萌发剂包括氨基酸类、嘌呤衍生物和糖类[16—_，在某些情况下芽孢萌发也可由多种营养萌发剂联合触发。，陈越等1i:8]通过微分干渉差显徵成像（DIC)方法#高通量实时监测芽孢萌发过程，通过DIC的强度变化观察芽抱皮层水解情况，研究发现苏金去芽孢杆菌在外源性CaDPA的作用下，95%的芽孢在10min中萌发，可见CaDPA对芽孢皮层溶解的诱导作用比一些营养性萌发剂还要强。3.1.1营养性萌发剂与特异性受体结食：当芽抱暴露于营养性萌发剂中时，营养性萌发剂穿透芽孢衣和皮层，与位于芽孢内膜的萌发受体蛋白(GR)结合D不同种属的芽孢，含有一种或多种受体愈动子，可识别不同的营养性萌发剂。GotA蛋白家族是最常见的萌发受体蛋白,GerA操纵子编码三种蛋__，包括GerAA,.CietrAB和.Gei'AC。__G_er-AAI种跨膜蛋膚，跨膜区域至少穿过膜5次。,GerAB属于膜转运蛋良，燾非芽孢菌种中蛋：!白质具有部分同源性GerA操纵子编码的三种蛋白质形成受体复合物，在芽孢中识别营养性萌发剂。:Gei'P突变体菌株在不移除芽孢衣的条件下萌发速度很慢，同时其菌落形成能力也显著降低，移除芽孢衣可恢复芽孢萌发能力和菌落形成能雜:11期徐智勇等:芽抱生成和萌发相关机制•171•力，说明GorP编码的蛋白质对于建立萌发促进剂可穿透的芽孢衣起到重要作用[2〇_21]。3.1.2受体不可逆结合：受体结合反应不可逆转，即使移除营养萌发剂或置换受体蛋白上的结合配体，芽孢萌发仍会持续进行，见图3。Behra-van等_在研究中貪先发现受体结合的不麗逆识别反应，自#孢暴露于L-丙氨酸中时，即使移除L-丙氨酸芽孢仍会继续萌发。不同种属的细菌，不可逆识别反应的时间不同&有研究者在末端芽孢杆菌菌株的研究中发现在Jmin之内添加D-丙氨酸可阻止L-丙氨酸诱导的莽孢萌发，超过5min中芽孢萌发不再受D-丙氨酸影响。，Jfc*.l-Alanine(A)+R~—^ARt^AR*—►GerminationA+R*----------------1图3芽孢营养性萌发剂同受体不可逆结合模型注:R为芽孢内膜变构受体蛋_¥可同L-丙氨酸结合形成活性蛋白AR*，当AR*含量达到阈值，则不可逆引萌发孢萌发。3.1.3离子流和DPA分泌：普养性萌发剂同位于芽孢内膜受体不可逆结合，后，诱导芽孢分泌一价.阳离子如H%Na+_.jr及大分子物质GaDPAc:H+分泌到胞外使芽孢内核pH并高，为后续芽孢内部新陈代谢活动提供了合适的pH环境。CaD-PA的分泌，彳吏芽孢的折光性逐步消失，同时CaD-PA的释放也伴随着:内核含水量的增加，痺葬孢逐步失去其高度抗逆性。3.1.4皮层水解：皮雇水解酶活化，促进芽孢皮层大分子肽聚糖的水解。皮层水解降低了皮层对芽孢核心的保护，芽孢核心吸水弁使水分含量恢复至营养菌体水平核心的完全水合作用，使得酶活力、胞内代谢逐步恢复，芽孢恢复生长■3.2萌发相关信号通路枯草芽孢杆菌中，常见的萌发剂包括L-丙氨Ife.-,AGFK(L-aspai'agine,fructose,gkicos#andKC1)和200-4〇OMPa_擔静水M(HHP),不同的萌发剂与不同的GR受体结合，通过下游信署通道转导诱导芽孢萌发6GR受体介导的萌发擊号在胞内经过转导和信号扩大，诱导一价阳离予和DPA分泌M1，DPA以钙盐CaDPA的形式通过DPA通道释放，诱导皮层水解酶（CLE)的激活，逐步诱导皮层肽聚糖水解，核心完全水食后，芽孢萌发63.3芽孢萌发其他通路外源性CaDPA、表面活性剂等物质也可诱导芽孢萌发。外源性CaDPA宣接通过激活CLE来诱导芽孢萌发，而表面活性剂则是通过与芽孢内膜作用，诱导CaDPA的释放，进而激活CLE诱导芽孢萌发。上述芽孢萌发通路均无需营养型受体参与，直接通过CaDPA通道，激活皮层水解酶，进而诱导芽孢萌发。吴艳艳等[34]在一系列的研究中发现质粒pHT73可影响芽孢的发芽率,该质粒缺失突变后;芽孢萌发率增高，推知质粒PHT73含有莽孢萌发相关基因，该基因的表达会阻碍芽孢萌发通路，但不会完全阻断，見其信号传导途径#操纵子GerX相似，但其具体调控机制有待进■步研究t4结语芽孢作为营养菌体的休眠形式，通过形成芽孢特有的多层同心売层保护性结构，使芽孢能够抵抗多种外界压力,在一定条件下可重新萌发恢复至臂养菌体进行繁殖生长9莽孢结构的相关研究比较透彻，但芽孢生成及芽孢萌发相关信号通路及蛋白街前仍需要大量研究探讨（如对裹吞作用的分子机制、萌发剂转运进透过皮层的机制、萌发剂同受体结合后信号的传导机制等仍了解尚少，有待进一步研究。参考文献[1]KlobutcherLA,RagkousiK,SetlowP.TheBacillussubtilissporecoatprovidesueatresistance，Jduringphagocyticpreda­tionbytheprotozoanTetrahymenathermophila[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(1)：165-170.[2]SetlowP.SporesofBacillussubtilis：theirresistancetoandkillingbyradiation,heatandchemicals[J].JApplMicrobi­ol,2006,101(3)：514-525.[3]LaaberkiMH,DworkinJ.RoleofsporecoatproteinsintheresistanceofBacillussubtilissporestoCaenorhabditiseleganspredation[J].JBacteriol,2008,190(18)：6197-6203.[4]RiesenmanPJ,NicholsonWL.