生物技术在作物育种中的利用-分子标记辅助选择育种

第十四章分子标记与作物育种绪分子标记辅助选择(MAS)的主要进展1.基因聚合(genepyramiding)2.基因转移(genetransfer)3.数量性状的MAS第一节.分子标记的类型和作用原理遗传标记（geneticmarker）:指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记的类型形态学标记（morphologicalmarker）细胞学标记(cytologicalmarker)生化标记(biochemicalmarker)分子标记(molecularmarker)：DNA分子遗传标记，或DNA标记。即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点：形态标记简单直观、经济方便；缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响，(3)有一些标记与不良性状连锁。(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。形态标记即植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。因此到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。细胞学标记主要包括同工酶和等位酶标记。同工酶是：指结构不同、功能相似的酶，也即具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。属于一个以上基因座位编码的酶的不同形式；而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。生化标记•与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。一、分子标记标记的类型和特点目前的分子标记类型第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术（DNAFingerprinting）等；第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等；第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等。分子标记的特点：（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定（2）数量多（3）多态性高（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。（6）成本不太高二、分子标记的原理和遗传特性(一)RFLP标记1.RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。基本步骤用DNA限制性内切酶消化Southern杂交放射性自显影或酶学检测DNA提取凝胶电泳分离，转移到滤膜上2）特点A无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。BRFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。C在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰DRFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限制EDNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。PCR-basedmarkersPCR:polymerasechainreaction（多聚酶链式反应）amplificationoftractsofDNAdefinedbybordersequencesthathybridizetoselectedDNApolymeraseprimersRequires:-targetDNA-thermostableDNApolymerase(Taq)-oligonucleotideprimer(s)(7-30nt)-dNTPs+Mg++（二）RAPD标记1.RAPD标记原理RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。（三）AFLP•1.原理SILVER-STAININGChemiluminescenceLabeled复件ISTRtiereDIG拷贝.gifIsotope(P33/P32)LabeledFluorescencelabeledSILVER-STAININGChemiluminescenceLabeled复件ISTRtiereDIG拷贝.gif2.AFLP标记的主要特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。（四）SSR•1.原理（四）SSR1987年Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，它们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR（variablenumbertandemrepeat）。VNTR标记包括小卫星（minisatellites）和微卫星（microsatellites）标记两种。微卫星标记即SSR标记，是一类由1-6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。如（CA）n，（AT）n，（GGC）n、（GATA）n等重复，其中n代表重复次数，其大小在10-60之间。这类序列的重复长度具有高度变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组的研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依次为：（AT）n、An、Tn、（AG）n、（CT）n、（AAT）n、（ATT）n、（GTT）n、（AGC）n、（GCT）n、（AAG）n、（CTT）n、（AATT）n、（TTAA）n、（AAAT）n、（ATTT）n、（AC）n、（GT）n等。1、SSR标记的原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序如下：①建立基因组DNA的质粒文库；②根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲得到（AT）n/（TA）nSSR，则可合成G（AT）n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；③对阳性克隆DNA插入序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；⑥高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建，品种指纹图谱绘制及品种纯度检测以及目标性状基因标记等领域。特别在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取代RFLP标记的第二代分子标记。•SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。SNPMarkers英文缩写英文名称中文名称RFLPRestrictionfragmentIengthpolymorphism限制性片段长度多态性STSSequencetaggedsite序列标签位点RAPDRandomamplifiedpolymor-PhicDNA随机扩增多态性DNAAFLPAmplifiedfrangmentlengthPolymorphism扩增片断长度多态性SSRSimplesequencerepeat简单序列重复SNPSimplemucleotidepolymor-phism单核苷酸多态性几种主要的ＤＮＡ分子标记表主要分子标记产生体系及特点------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------比较内容RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCARSTSCAPS------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------主要原理限制酶切随机PCR扩增限制性酶切PCR扩增随机PCR扩增特异PCR扩增特异PCR扩增PCR扩增产物southern杂交结合PCR扩增限制性酶切------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------探针或引特定序列9-10bp由核心序列酶切特异引物以2-、3-、4-RAPD特征带RFLP探针序列特异引物，物来源DNA探针随机引物位点及选择性碱基核苷酸为基元的测序设计的Alu-因子、YAC、组成的特定引物不同重复次数作为引物特异引物Cosmid插入末端序列设计引物------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------基因组中丰富度中等很高高高高中等（？）中等中等（？）多态性水平中等较高非常高高高中等检测基因组区域单/低整个整个重复重复序列间隔整个单拷贝区整个拷贝区基因组基因组序列的单拷贝区基因组基因组---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------