第五章分子标记辅助育种

植物分子育种分子标记辅助育种DNA标记辅助选择育种是利用与重要经济性状连锁的DNA标记或功能基因来改良动、植物品种的现代分子育种技术；基因工程育种转基因育种则是通过向受体植物转移有重要功能的基因或一组功能相关的基因来改良植物性状的育种技术。分子标记辅助育种标记辅助育种（Markerassistedselection)是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。遗传标记(geneticmarkers)是基因型的特殊的易于识别的表现形式。第一节遗传标记发展理想的遗传标记主要应具备以下标准:–(1)具有较强的多态性;–(2)表现为共显性(codominance);–(3)选择中性，对主要的农艺性状没有影响;–(4)容易操作．自动化程度高。–5)重复性好；–6)所得数据可在实验室之间交流和比较。多态性或遗传多态现象(GeneticPolymorphism)是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或两种以上不连续的变异型或基因型，每种类型的比例较高,不能由重复突变来维持。遗传标记主要有四种类型:形态标记（morphologicalmarker）细胞标记（cytologicalmarkers）生化标记（Biochemicalmarker）–同工酶:酯酶和过氧化物酶–贮藏蛋白分子标记（molecularmarker）分子标记的优越性：直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性。Singlebasemutation–Insertion/deletion–RearrangementBasedonvariationintheDNAsequenceMolecularMarkerCAPACITY1985199019952000DNAChipsISSRAFLPsSSRsRAPDsRFLPs????AdvancedinMolecularMarkers第二节分子标记技术几种常用的分子标记技术l基于Southern杂交的分子标记基于PCR技术的分子标记一、基于Southern杂交的分子标记限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）1RFLP标记RFLP标记的原理植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。RFLP标记的特点（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中二、基于PCR技术的分子标记随机扩增片段长度多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA）特异性扩增子多态性（SpecificAmplificonPolymorphism，SAP）简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR）扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）1RAPDsAnonymousmarkers-butcanbeconvertedtoSCARsDominantmarkers-homozygotescannotbedistinguishedfromheterozygotesFast,easyandcheap-commercialprimersetsavailablePCR-basedmarkers2SSRmarker简单重复序列（SimpleSequenceRepeat，SSR）或称微卫星DNA（MicrosatelliteRepeat）、简单串联重复序列（ShortTandemRepeatPolymorphism，STRP）。微卫星分子标记对18份山羊草基因型的扩增结果基本步骤设计探针，筛选重组克隆根据SSR两侧序列设计并合成引物PCR扩增反应建立基因组DNA的质粒文库对阳性克隆DNA插入序列测序凝胶电泳检测多态性Chromosome1,Region11(bin1.11)Thispagesummarizesthedataavailabledescribingfeaturesfoundinbin1.11inmaize.Whatisabin,andwhyisitimportant?Thisregionishighlightedinredontheimageofmaizechromosomestotheright.Youcanclickonregionsofthatimagetomovetootherportionsofthemaizegenome.GenesinBin1.11OtherLociinBin1.11Bin1.11High-DensityMapRegionsSequencesinBin1.11ESTContigsinBin1.11SSRsinBin1.11BACsinBin1.11Mappedlociw/accessionsinBin1.11MapLocationsofSequencesinBin1.11(AC)20p-umc1797(ACAA)4p-umc1421(ACC)4p-umc1500(ACC)5p-umc1725(AG)10p-umc1538(AG)6p-umc1220(AG)8p-umc1553(AGA)7p-umc1737(ATGGG)4p-umc1630(CA)10p-mmc0221(CA)14p-mmc0031(CA)15p-mmc0011(CAAAA)4p-umc1111(CCG)4p-umc1681(CGT)5p-umc2241(CT)8p-umc1064(GA)8p-umc1862(GAGCA)4p-umc1118(GCGCCG)4p-umc1744(GCT)4p-umc2045(GGC)4p-umc2244(GGT)10p-umc1331(GT)7(GA)7p-umc1009(TC)8p-umc1129(TCTCC)4p-umc2243(TGC)6p-umc2242AAGp-phi120ACCp-phi227562AG(16)p-bnlg2331AG(22)p-bnlg1055AG(31)p-bnlg2123AGGp-phi265454ATCCp-phi064p-(GATA)2(GACA)2p-bnlg131p-bnlg257p-bnlg504p-bnlg6673AFLPmarker扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP），又称选择性限制片段扩增（SelectiveRestrictionFragmentAmplification）。双酶切连接节头预扩增选择性扩增ThespecificbandinXianyou63amplifiedwithAFLPprimercombinationE-AAC/M-CATCAP标记Indica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATJaponica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATIndica(51)TACTTGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGJaponica(51)TACTAGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGJaponica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTSBE1片段LeftprimerRightprimerSNP标记Indica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATJaponica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATIndica(51)TCCATGTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGJaponica(51)TCCATcTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGJaponica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTSBE1片段LeftprimerRightprimerGCATPCR变性，退火GCATCELI变性走胶，检测第三节分子标记在育种中的应用分子图谱的构建品种、品系鉴定和杂交种纯度分析亲缘关系分析基因标记及标记辅助育种（Marker-assistedSelection，MAS）数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择1分子图谱的构建主要包括以下步骤：–根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；–群体中不同植株或品系的标记基因型分析；–标记间的连锁关系。构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。用于分子标记的遗传作图可分为两类：a)暂时性分离群体，包括F2群体、BC等b)永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等自花授粉作物作图群体的构建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL异花授粉作物作图群体的构建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg杂合F1对B、D、G位点来说，相当于F2对A、C、E位点来说，相当于测交F位点不分离F2BC1DHRIL群体形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要的群体规模大大中中分离比例1:2:3或3:11:11:11:1不同作物群体的特点2品种、品系鉴定和杂种纯度分析在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的DUS（Distinctness，Unformity，Stability），为品种审定、保存、保护提供依据。指纹图谱要求：分辨率高，多态性强；重复性好，稳定可靠。ThespecificbandinXianyou63amplifiedwithAFLPprimercombinationE-AAC/M-CAT123ComplementarypatternamplifiedwithAFLPprimerpairEcoRI-AAG/MseI-C