糖的核磁共振性质

第五节糖的核磁共振性质一、糖的1HNMR性质1、糖的端基质子信号在δ5.0ppm附近，多数呈现特征性的双峰，少数呈现宽单峰。2、糖环质子信号在δ3.5—δ4.5ppm之间。3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基质子信号在δ1.0ppm附近.4、糖的C1-H与C2-H的偶合常数，广泛应用于吡喃糖环端基碳原子构型的判断。※原理：绝大多数的D-吡喃糖(如葡萄糖),当C1-OH处于横键上(代表β-苷键),C1-H与C2-H的偶合常数J=6-8Hz;当C1-OH处于竖键上(代表α-苷键),C1-H与C2-H的偶合常数J=2-4Hz。※原因：质子间的偶合常数与两面角有关。OORHHOHOORHHOH18060。。-D-glucose-D-glucoseC1-HC2-H近180（双面角）J=6~8Hz。C1-HC2-H近60（双面角）J=2~4Hz。αβ※C2-H始终处于竖键上是判断的前提。※甘露糖与鼠李糖，虽然具有吡喃环结构，但其C2-H都处于横键上，故无法判断其苷键构型。22OORHOHHOOROHHH-D-甘露糖-D-甘露糖C1-HC2-H都约为60（双面角）。αβOORMeHeOHHeOORMeHaOHHe-L-鼠李糖-L-鼠李糖αβ◆鼠李糖优势构象是1C式1212112233ORHeHeOHC3OC2ORHeHeOHC3OC2α-L-鼠李糖苷β-L-鼠李糖苷φ=600φ=600C1二、糖的13CNMR性质（一）化学位移与偶合常数1、D-吡喃糖的化学位移值C1:α-型97～101ppmβ-型103～106ppmCH-OH(C2、C3、C4)70～78ppmCH2-OH(C6)62ppm左右CH3（糖的甲基C）18ppm左右~100~~78~~62~C1C3C2C4C6※一般在13C-NMR谱中2、D-呋喃糖的化学位移值CH2-OH(C1)64ppm左右CH-OH（C3、C5）80ppm（偏大）3、13C谱化学位移数据的应用①依据97～106ppm区域13C信号的个数可判断低聚糖及其苷中所含糖基的个数.②如果端基13C信号出现在大于100ppm的区域，则苷键构型为β-D或α-L；如果端基13C信号出现在小于100ppm的区域，则苷键构型为α-D或β-L。③依据13C谱数据尚可判断氧环的大小。◆对于呋喃氧环CH-OH（C3、C5）80ppm◆对于吡喃氧环CH-OH（C3、C5）78ppm4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常数(1JC1-H1)可用于苷键构型的确定.①对于D-吡喃糖甲苷：α-苷键JC1-H1≈165~170Hzβ-苷键JC1-H1≈155~160Hz例如：α-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=166ppm;β-D-甘露糖甲苷1JC1-H1=156ppm。②对于L-鼠李糖甲苷：α-苷键JC1-H1≈165~170Hzβ-苷键JC1-H1≈155~160Hz例如：α-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=168ppm;β-L-鼠李糖甲苷1JC1-H1=158ppm。5、呋喃型糖苷无法用端基碳与端基质子的偶合常数来判断其苷键构型。（二）苷化位移（glycosydationshift）1、概念：糖成苷后，糖的端基碳和苷元α-C、β-C的化学位移值均发生改变，这种苷化前后化学位移的变化现象，称为苷化位移。OOCH2CH2Rαβ端基碳苷元碳2、苷化位移一般规律①端基碳、苷元α-碳的化学位移值向低场方向移动5～6ppm（+5～+6）单位；②苷元β-碳的化学位移值向高场方向移动3～4ppm（-3～-4）单位；③糖分子其他碳原子化学位移值变化不大。④苷元β-位有取代基时的苷化位移规律：OORR+3.4+6.8-0.6-4.7R-R◆苷元α-碳和糖端基碳绝对构型都为R（或S）时，苷化位移规律同①、②。端基碳α-碳β-碳◆苷元α-碳和糖端基碳绝对构型不同时，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元β-位无取代基者大约高3.5ppm单位。OORS+7.6+10.6+0.2-1.7相应增加约3.5ppmR-S端基碳α-碳3、酯苷、酚苷的苷化位移规律：苷化位移值较特殊，端基碳与羰基碳（即苷元α-碳）均向高场方向位移，β-C向低场方向位移。例如：齐墩果酸在成苷后，其分子结构中既含醇苷、也有酯苷结构。可用于对比有关碳原子化学位移值的变化情况。OHCOOH-D-Glcβ-D-GlcβC1=106.9C1=95.7+0.3-0.8-0.2-3.9-1.2+10.3+0.334172215酯苷键醇苷键齐墩果酸端基碳端基碳α-Cα-Cβ-Cβ-COOHOHOHOH-D-GlcβC1=101.1-0.7-0.9+1.6+0.8酚苷键α-Cβ-Cβ-Cα-C4、苷化位移有关说明：①苷化位移值与苷元的结构有关，与糖的种类无关。OMeOOMeOβ-D-葡萄吡喃甲苷13C1=104.0ppmβ-D-甘露吡喃甲苷13C1=104.5ppm②如果苷元为链状结构，则糖端基碳的苷化位移值随着苷元为伯、仲、叔基而递减。例如：与糖的甲苷化学位移比较，苷元分别为伯、仲、叔基时，糖端基碳的苷化位移值的变化情况如下，OOCHCH3CH3OOCCH3CH3CH3OOCH2CH3端基碳化学位移值下降-2-4-7③在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的α-C的化学位移变化较大些，β-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。④在确定了苷中糖的种类以后，将苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较，利用苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置◆将双糖苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较；◆如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向低场方向移动了（通常是4~7ppm),而与其相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场方向移动（约1~2ppm),则内侧糖的这个碳原子就是糖的连接位置。三、红外光谱IR1.3700～3100cm-1间有明显O-H吸收峰。2.如糖分子中含羧基、酰基等，则相应官能团的IR吸收峰可见。3.多糖在1500～960cm-1有许多吸收峰，其中970～730cm-1间的峰可用作端基碳构型判断。例如：840cm-1吸收峰——α-L-吡喃糖苷890cm-1吸收峰——β-D-吡喃糖苷四、质谱1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发性的衍生物才能进行质谱分析。2、糖的立体异构体往往出现几乎相同的质谱，仅在碎片丰度上稍有区别（不能用质谱来区别糖的构型！）。3、糖和苷的分子量：可用CI(化学电离),FD-MS、FAB-MS等方法获得分子离子峰后测出。4、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。如果事先测定了多糖的组成，则可根据质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。第六节糖链的结构测定※主要解决四个问题①单糖的组成；②糖的氧环大小；③糖与糖之间的连接位置和顺序；④苷键构型。（一）纯度测定方法1、高压电泳法※原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。※电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。※缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。※电压：30-50V/cm※时间：30-120min※显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。※注意：必须使用冷却系统，将温度维持在0℃,以免烧坏支持体。※本法常用2、超离心法※原理：由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小与形状有关，故将多糖溶液进行密度梯度超离心时，如果是组成均一的多糖，则应呈现单峰。※具体做法：将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐溶液，接着进行密度梯度超离心，待转速达到恒定后（6000转/min），采用间隔照明法检测其是否为单峰。3、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10%左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同则为纯品，否则为混合物。4、其他方法如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。（二）分子量测定1、测定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。2、凝胶过滤法简介：在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的分子量。◆该法用量小、操作较简便。3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定※最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS4、多糖分子量的测定方法①基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）②基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS).（三）单糖的鉴定1．纸层析①展开系统：常用水饱和的有机溶剂如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展开方式：上行、下行等③显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后引起的一些呈色反应。例如，※邻苯二甲酸苯胺※硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色）※三苯四氮唑盐试剂（单糖和还原性低聚糖呈红色）※3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂（酮糖呈红色）※过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。2．薄层层析①采用（硼酸液/无机盐）+硅胶→制板②吸附剂：硅胶③显色剂：除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、苯胺-二苯胺磷酸试剂等。3．气相层析①将糖制备成三甲基硅醚②醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。4．离子交换层析①原理：糖的硼酸络合物可进行离子交换层析②优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液进行分离（与气相比较）③需要仪器—糖自动分析仪5．液相色谱①填充材料——化学修饰的硅胶②优点：不必制备成衍生物。适合分析对热不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。③缺点：灵敏度不及气相层析高。◆多糖组成的鉴定1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。（四）糖连接位置的测定1、化学方法：多采用甲基化法①过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物—甲基化单糖—进行定性和定量分析。②甲基化过程：常用箱守法(Hakomori)③水解过程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/LH2SO4或三氟乙酸水解。④气相色谱法定性和定量分析：选择各种单糖的标准品，分别与水解后得到的各种甲基化单糖进行比较，具有游离-OH的部位就是糖的连接位置，而全甲基化的单糖即为末端糖。⑤计算过程：算出所得各甲基化产物相互之间的比例，据此可推测出糖链重复单位中各种单糖的数目。++OOMeOMeOMeCH2OCH3H,OHOOMeOMeH,OHOOMeCH2OCH3H,OHOHOHOOMeOMeOMeH,OHCH3OOOOOOCH3OH,OHCH2OHOMe①全甲基化②水解游离羟基游离羟基2、NMR谱法（了解内容）①13CNMR谱法：目前用来确定糖的连接位置的常用方法※该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。②1HNMR谱法：※先使糖与苷乙酰化，再比较不同类型质子的化学位移。例如：CHOAc中CH质子的化学位移为4.75~5.4ppm;而CH2OAc、CH2OR中质子在3.0~4.3ppm；端基质子介于这两者之间。※通过2D-NMR判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。