黄酮类化合物的提取与分离

黄酮类化合物的提取与分离一、提取)^/R3z3e'E.K-x3\6n:w8b黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。&J,x9V9M1k.g3y%N黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇－水（1∶1）或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸（如0.1％盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用，以免发生水解反应。为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解，常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元，可用苯进行提取。$m0p4b+E8l%V/`}0l7Z%J)U对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有：（一）溶剂萃取法：利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。例如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。常用的溶剂系统有：水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。!{2y/ma;t溶剂萃取过程在除去杂质的同时，往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。}'o;|?0S,r8X/N:W（二）碱提取酸沉淀法黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。槐米（槐树SOphorajaponicaL．花蕾）加约6倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至pH8～9，在此pH条件下微沸20～30min，趁热抽滤，残渣再加4倍量的水煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在60～70t的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至PH为5，搅匀后静置24h，抽滤。用水将沉淀物洗至中性，60℃干燥得芦丁粗品，用沸水重结晶，70一80℃干燥后得芦丁纯品。在用碱酸法进行提取纯化时，应当注意所用碱液浓度不宜过离，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低产品收率。当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀，不被溶出。这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网-z7L9i;v9Z.N$\&Q#Ss（三）炭粉吸附法主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、佛甲醇、7％酚一水、15％酚一醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查（或用PPC鉴定）。通过对BaPtisialecontei中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用7％酚一水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网5H6u,_7c1Nf-o/s1k二、分离现将较常用的分离方法介绍如下：)r*}(y.U,u3a（一）柱色谱法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。1．硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。2．聚酰胺柱色谱对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。以Baptisialecontei为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：（1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。^#e5T4A(\+q4f（2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数目相同时，羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。（3）不同类型黄酮化合物，先后流出顺序一般是：异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。（4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。(^,L9~8l2v4z3．葡聚糖凝胶（Sephadexgel）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex－G型及Sephadex－LH－厂－型。用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是：中国植物提取物论坛4A'^(T%L6q&p4a分离游离黄酮时，主要靠吸附作用。凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。表6-5中Ve为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积；V0为柱子的空体积。Ve／V0数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。上表所列数据清楚地表明：苷元的羟基数越多，Ve／V0越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则Ve／V0越小，越容易洗脱。葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：中国植提论坛|植提网c0h2w'G$H1f*]（1）碱性水溶液（如0．1mol／LNH4OH），含盐水溶液（0．5mol／LNaCI等）。&i!r&}.Z6F.B2z1T$|'R;i（2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇－水（不同比例），叔丁醇－甲醇（3：1）、乙醇等。（3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇－氯仿等。~)]4e5m!d8Q,@'e'}+a;l（二）铅盐法:I5R此法过去曾用于研究，目前已很少采用。一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离，再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中，脱铅后得到成分。（三）硼酸铬合法有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合，生成物易溶于水，借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。（四）pH梯度萃取法`7u.U-{5b#^pH梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用5％NaHCO3（萃取出7，4′－二羟基黄酮）、5％Na2CO3（萃取出7－或4′－羟基黄酮）、0.2％NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮）、4％NaOH（萃取出5－羟基黄酮）萃取而使之分离。植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网/L,G;w9w)k-H植提之家,植提空间,中国植提论坛,植提论坛,植提网%L,J-A7f+j4W0o+U-q3u.h黄酮类化合物的鉴别与结构测定中国植物提取物论坛^,W2dUr${.?一、利用紫外光谱测定黄酮类化合物的结构大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在300～400nm之间的吸收带称为带Ⅰ，出现在240～280nm之间的吸收带称为带Ⅱ。不同类型的黄酮化合物的带Ⅰ或带Ⅱ的峰位、峰形和吸收强度不同，因此从紫外光谱可以推测黄酮类化合物的结构类型。中国植提论坛|植提网5k,c2~)n7A:J/L9?+E/H8y当向黄酮类化合物的甲醇（或乙醇）溶液中分别加入甲醇钠（NaOMe）、乙酸钠（NaOAc）、乙酸钠-硼酸（NaOAc-H3BO3）、三氯化铝或三氯化铝-盐酸（AlCl3/HCl）试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等，导致光谱发生变化。据此变化可以判断各类化合物的结构，这些试剂对结构具有诊断意义，称为诊断试剂。3c:x-V^3B'E1F1D黄酮和黄酮醇类（一）黄酮、黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征中国植提论坛|植提网1U'Z'U3e8~#a/z;D%p,b2|7w黄酮或黄酮醇的带Ⅰ是由B环桂皮酰基系统的电子跃迁所引起的吸收，带Ⅱ是由A环的苯甲酰基系统的电子跃迁所引起的吸收。$@&Q!p+g2u0h黄酮和黄酮醇的UV光谱图形相似，仅带Ⅰ位置不同，黄酮带Ⅰ位于304～350nm，黄酮醇带Ⅰ位于358～385nm。利用带Ⅰ的峰位不同，可以区别这两类化合物。黄酮、黄酮醇的B环或A环上取代基的性质和位置不同将影响带Ⅰ或带Ⅱ的峰位和形状。例如，7和4′位引入羟基、甲氧基等含氧取代基，可引起相应吸收带向红位移。又如3-或5-位引入羟基，因能与C4＝O形成氢键缔合，前者使带Ⅰ向红位移，后者使带Ⅰ、带Ⅱ均向红位移。B环上的含氧取代基逐渐增加时，带Ⅰ向红位移值（nm）也逐渐增加，但不能使带Ⅱ产生位移。有时（例如3′，4′-位有2个羟基或2个甲氧基或亚甲二氧基）仅可能影响带Ⅱ的形状，使带Ⅱ歧分为双峰或1个主峰（Ⅱb位于短波处）和1个肩峰（sh）或弯曲（Ⅱa位于长波处）。0~-X6U;J5\&Y-z%P/Of'KA环上的含氧取代基增加时，使带Ⅱ向红位移，而对带Ⅰ无影响，或影响甚微（但5-羟基例外）。中国植物提取物论坛#y7C5\2n:x!u7~)U.I4@黄酮或黄酮醇的3-，5-或4′-羟基被甲基化或苷化后，可使带Ⅰ向紫位移，3-OH甲基化或苷化使带Ⅰ（328～357nm）与黄酮的带Ⅰ的波长范围重叠（且光谱曲线的形状也相似），5-OH甲基化使带Ⅰ和带Ⅱ都向紫位移5～15nm，4′-OH甲基化或苷化，使带Ⅰ向紫位移3～10nm。其他位置上的羟基取代对甲醇中的紫外光谱几乎没有影响。/r7w,k4@/m'j8a*~#b,V,g（二）利用诊断试剂对黄酮、黄酮醇类化合物UV光谱的影响检出羟基位置1．甲醇钠（NaOMe），主要是判断是否有4′-OH，3、4′－二OH或3、3′、4′－三OH。2．乙酸钠，较为突出的是判断是否有7-OH。［举例说明］3．乙酸钠/硼酸主要判断A环或B环是否有邻二酚羟基（5，6-二OH除外）。［举例说明］4．三氯化铝及三氯化铝/盐酸，为判断有无邻二酚羟基，3-OH、5-OH提供信息。(m8R6k;H6X)j$k].Z（三）异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征这三类化合物都有苯甲酰系统，而无桂皮酰结构，所以它们的紫外光谱都有强的带Ⅱ吸收，异黄酮带Ⅱ吸收在245～270nm，而二氢黄酮和二氢黄酮醇的带Ⅱ在270～295nm，一般只受A环的含氧取代基的影响，A环含氧取代基数增加，吸收峰向红位移。（四）利用诊断试剂对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类化合物的UV光谱的影响判断羟基位置1．甲醇钠①带Ⅱ向红位移，示A环上有羟基。②如有5，6，7-或5，7，8-三羟基或3′，4′-二羟基，则吸收带将随放置的延长而逐渐衰退。;f3VO1g0L!R0|③二氢黄酮、二氢黄酮醇带Ⅱ向红位移的大小取决于是否有游离的5-OH。!Q(_3N@)m4j2．乙醇钠:]:x'|H①乙醇钠使7-羟基异黄酮的带Ⅱ向红位移6～20nm，但6-位有含氧取代基时，乙醇钠几乎不能使带Ⅱ产生移动。