dld006-蛋白定量(BCA法)-最强实验protocol

Adld’sLaboratoryManual©AllRightsReserveddld47蛋白定量ProteinQuantitation【蛋白定量的背景知识】“蛋白定量”即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的“个别定量法”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。①为验证细胞裂解是否成功；②或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量；③为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量；④为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。蛋白定量分析涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及打击掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。【蛋白定量的方法】蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是一项经常进行的非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。现测定蛋白质含量方法有很多：①根据物理性质：紫外分光光度法；②根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法；③根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法；④根据其他性质：荧光法；蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。当然，每种方法适用的情况都有所不同。实验最常用的蛋白定量方法为BCA法和Bradford法（也就是考马斯染色法）。Adld’sLaboratoryManual©AllRightsReserveddld48BCA蛋白定量和Bradford法蛋白定量的区别（1）Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性；该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量，如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂（裂解液）的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。（2）BCA法蛋白浓度定量是Cu2+在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成Cu+（BiuretReaction），Cu+和独特的BCASolutionA（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个Cu+，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收波峰的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。【内参（基因/蛋白）的背景知识】WesternBlot实验常用于检测蛋白表达量、蛋白表达产物的正确性等。相对于其他检测蛋白的方法而言WesternBlot实验在蛋白的定性定量分析、与“目的蛋白”量的比较方面更简单一些。在定量分析时，为排除各样本蛋白总量不同的干扰，WB的每个样本的“上样量”（并不仅仅指上样量的体积）即对应泳道的蛋白总量应该均一。因此需提前对各蛋白样本进行定量，使得各样本的蛋白浓度一致，如此WB时，当每泳道上样体积一致时，则对应的蛋白总量也一致。作为Control，应选择能在各个细胞都能稳定表达的内参基因（常见的内参基因有β-Actin，GAPDH等，具体需参考文献），如WB的结果显示内参基因一致，则表明本次实验各泳道的蛋白总量一致，实验也就具备了分析的前提和基础。内参即是内部参照(InternalControl)，对于哺乳动物细胞表达来说一Adld’sLaboratoryManual©AllRightsReserveddld49般是指由管家基因编码表达的蛋白(HousekeepingProteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WesternBlotting实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。虽然，顺利的时候WesternBlot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果、假阳性、结果出现多条带、到底是一抗有问题还是二抗有问题……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不像“1+1”那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性。所以，严谨的WesternBlot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果的分析非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮，怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)、空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照)、已知量标准产物的正对照，另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做WesternBlot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果，即便有结果也可能影响结果的分析。实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用WesternBlot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，WesternBlotting实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在WesternBlotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质如DNA的干扰，且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法敏感Adld’sLaboratoryManual©AllRightsReserveddld50度最高，且与一系列干扰Lowry、BCA反应的还原剂(如DTT，巯基乙醇)相容，但是对去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Westernblotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。在WesternBlot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。在WesternBlotting实验过程中使用内参的方法通常有以下三种：（1）第一种是超级简便的标记内参使用法，只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可;（2）第二种是普通内参，当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。（3）第三种（最常用），当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行孵育，二抗孵育以及显色。常用的蛋白质内参有GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差10kDa以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参。【β-Actin、GAPDH、Tubulin的具体应用】actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletalmuscleactin、alpha-cardiacmuscleactin、alpha-smoothmuscleactin和gamma-smoothmuscleactin，其余两种广泛分布于各种组织中，包Adld’sLaboratoryManual©AllRightsReserveddld51括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscleactin。这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论的。Beta-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性(疑似对于上样量20μg的蛋白区分能力下降)，但是发文章应该还是没有问题的。至于其他的内参也是可以考虑用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，而tubulin和actin类似，是细胞骨架的组成部分，但不是肌肉的主要成分，应该是一个代替品。上述三种内参同时发生变化的情况很少，需要具体分析。一旦出现上述三种内参同时发生变化，如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA，TATA-boxbindingprotein(TBP)甚至线粒体的内参来代替，当然一般这种可能性出现的几率微乎其微。不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C-端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有SantaCruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A197等)，ProSci(Cat#3779)，CellSignaling(Cat#4967)，AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。actin几种异构体存在组织分布特异性，不同型actin之间具有较高的序列相似性(90%)。β-actin是分