质粒提取protocol

QIAGENlarge-ConstructKit提取过程：准备工作：(1)100mlATP溶液：2.75g无水的ATP-Na2溶解于40ml双蒸水，用10MNaOH(约1ml)调pH至7.5，用双蒸水定容至50ml，分成300μl每小份保存于-20℃。(2)将RNaseA(220μl)溶液加入Buffer中，每瓶P1加一支RnaseA(用前离心)，终浓度为100ug/ml。(3)将225μlExoncleaseSolvent溶液加入ATP-DependentExonclease中，轻轻混匀。放置15min，不要激烈振荡，使其充分溶解。(4)检查P2中是否有SDS沉淀，如果有则溶解沉淀的SDS。(5)在4℃下预冷P3。(6)65℃预热QFBuffer。提取步骤：(1)从新制备的平板上挑取单克隆接种于2～10ml含有氯霉素（终浓度为12.5ug/ml）的LB液体培养基中，37℃，300rpm摇床培养大约8h。（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(2)取0.5～1ml菌液接种至500mlLB培养基中，即按1/500或1/1000的比例接种。37℃，300rpm摇床培养12～16h（使细胞密度达到3～4*109/ml）。（培养基的体积不超过培养瓶体积的1/4）(3)4℃，4000rpm（6000g）离心15min，以收集菌体。此菌体沉淀可存放到-20℃冻存。(4)用20mlP1buffer充分悬浮菌体（用P1buffer前检查是否添加了RNaseA，此步务必要充分悬浮以使菌体裂解充分）（如果没有60ml大小的管子，则可以将重悬后的细菌分到两个50ml的管子中，分别处理完第（5）（6）步在第（7）步后再混合到一起）。(5)加20mlP2buffer，轻柔颠倒4～6次，混匀，室温放置5min。此步加入P2buffer后要立即盖上盖子，以防止空气中的CO2与Pbuffer作用，同时放置时间不能超过4min，此时不能剧烈摇晃。(6)加入20ml冰预冷的P3buffer,立即颠倒混匀4～6次，冰上孵育10min。此步不能剧烈摇晃，冰预冷P3buffer可加强提取效果。(7)4℃，12000rpm离心30min，将上清转入新管。在离心之前应将样品再次轻柔混合。用三蒸水浸湿滤纸，过滤上清液(9)加入约0.6倍体积室温的异丙醇（大约36ml）至上清液中，颠倒混匀后立即4℃，12000（9500-11000）rpm离心30min，小心弃上清。(如果没有95ml大小的管子，可以将上清液分到两个50ml的离心管中5000g离心60min，然后同时进行第10步，第11步时再将两管混合)（10）加入5ml的70%乙醇洗涤的DNA沉淀，15000g离心15min。然后缓缓的倒出上清液。(11)将离心管倒置于纸上，干燥2～3min，后用9.5mlBufferEX重悬DNA沉淀，直到DNA完全溶解。（溶解时动作要轻柔，避免吸打）（12）加入200µlATP-DependentExonuclease和300µlATP溶液于溶解的DNA中，轻轻的完全混匀，然后37℃水浴或者37℃加热1h.如果溶液看起来比较浑浊，则可以15000g离心5min,然后迅速的移除上清液。(13)加入10mlQBTbuffer到Qiagen-tip柱子中,并使QBTbuffer自然流出。（14）向第12步中的DNA溶液中加入10mlBufferQS，将所有的DNA溶液加到Qiagen-tip柱子中，使其自然流出。(15)用QCbuffer清洗柱子两次，每次加30ml，让其通过柱子自然流出。(16)用65℃预热的15mlQFbuffer洗脱DNA，下面用干净的离心管收集洗脱液。(17)加入0.7倍体积室温的异丙醇（10.5ml）至DNA溶液中，颠倒混匀后立即，4℃，12000rpm离心30min,小心弃上清。(18)用5ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，4℃，12000rpm离心15min,弃上清。(17)室温干燥5～10min，用合适体积的TE溶解沉淀的DNA。（溶解DNA可以在室温条件下过夜或者55℃1-2h，避免吸打）（DNA过度干燥会使其不好溶解，如果缓冲液的酸度较高也会引起DNA溶解困难最好是在碱性环境下溶解）(18)电泳检测所提取的质粒。