两种检测糖化血红蛋白(HbA1c)方法的比较

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.1284两种检测糖化血红蛋白(HbA1c)方法的比较李俊敏1，杨莹1，董旭婉1，李杉1，王菊芳1，曹成喜2（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州510006）（2.上海交通大学生命科学与技术学院，上海200240）摘要：血液中糖化血红蛋白（HbA1c）水平是衡量人体内长期血糖状态的标准。国际临床化学和实验医学联合会（IFCC）将高效液相离子交换层析（HPLC）作为检测糖化血红蛋白的标准参考方法；而20mmol/LNaOH（阴极电解液）和20mmol/LH2SO4（阳极电解液）形成的稳定pH梯度及含两性电解质的凝胶使毛细管等电聚焦电泳（cIEF）在窄PH梯度下对糖化血红蛋白有着显著的分离效率;本文将对HPLC与凝胶cIEF进行分析比较。采用HPLC和凝胶cIEF方法分别测定随机46例血样样品的HbA1c值，对两组测定结果进行相关性分析。表明两种测定方法相关性良好；但是，由于HPLC方法易受血红蛋白变异体干扰，特异性较低；cIEF不受血红蛋白变异体干扰，特异性高。因此，凝胶cIEF方法可以作为HPLC的替代方法应于糖化血红蛋白的标准检测关键词：糖化血红蛋白；高效液相色谱；毛细管等电聚焦文章篇号：1673-9078(2016)1-284-289DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.1.045ComparisonofTwoMethodsforGlycatedHemoglobin(HbA1c)MeasurementLIJun-min1,YANGYing1,DONGXu-wan1,LIShan1,WANGJu-fang1,CAOCheng-xi2(1.SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofFermentationandEnzymeEngineering,Guangzhou510006,China)(2.LifeScienceandTechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,ShangHai200240,China)Abstract:Thelevelofglycatedhemoglobin(HbA1c)inthebloodisastandardmeasureofthelong-termglycemicstatusofthehumanbody.High-performanceliquidchromatography(HPLC)isthestandardreferencemethodforHbA1cmeasurementasdesignatedbytheInternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine(IFCC).Gel-capillaryisoelectricfocusing(cIEF)withastablepHgradientof20mmol/LNaOH(catholytesolution)and20mmol/Lsulfuricacid(anolytesolution)andgelscontainingampholyteshaveoutstandingseparationpower.Inthisstudy,HPLChasbeencomparedtogel-cIEFforthemeasurementofHbA1c.HPLCandgel-cIEFwereusedtomeasuretheHbA1cvaluesof46randomlyselectedbloodsamples.Correlationanalysisrevealedthatthetwomethodsshowedagoodcorrelation.TheHPLCmethodwaspronetointerferencebyhemoglobinvariantsandexhibitedlowspecificity.Thegel-cIEFmethodwasnotaffectedbyhemoglobinvariantsandshowedhighspecificity.Inconclusion,gel-cIEFcanbeusedasanalternativemethodtoHPLCforthestandarddetectionofglycatedhemoglobin.Keywords:glycatedhemoglobin;highperformanceliquidchromatography;capillaryisoelectricfocusing糖尿病是由血糖水平升高引起的一种慢性代谢紊乱性疾病，可导致多种并发症，包括心脏疾病，肾脏病，神经性疾病，坏疽，失明，和神经损伤等[1]。近年来，世界范围内的发病率逐年升高，2000年患病人数大约占世界人口的2.8%，2030年将达到4.4%，收稿日期：2015-04-25基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项项目“双向凝胶电泳（2DE）成套设备技术开发与应用的研究”（2011YQ030139）作者简介：李俊敏（1988-），女，硕士研究生，从事生物化学与分子学研究通讯作者：李杉（1972-），女，副教授，主要研究领域为生物化学与分子生物学，细胞生物学即2000年糖尿病患者为1.71亿，2030年预计将超过3.66亿[2]。对正常人及糖尿病患者血糖水平的监控，使血糖值保持在正常范围内，是减少糖尿病病人及预防糖尿病严重并发症的必要手段。糖化血红蛋白（HbA1c），糖化血红蛋白浓度和总血红蛋白浓度之间比率[3]。糖化血红蛋白是血红蛋白β链N末端缬氨酸的游离氨基与不同碳水化合物糖基化而形成的产物，合成过程缓慢且相对不可逆。因此，糖化血红蛋白可反映出机体1-2个月前的平均血糖水平，并且不受日常葡萄糖水平波动，是糖尿病诊断的标准之一[4]。2002年，美国糖尿病协会将检测糖化血现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.1285红蛋白（HbA1c）作为监测糖尿病血糖控制的金标准。临床检测糖化血红蛋白基准范围为5%至20%，4%至6.4%认为正常，6.5%以上需要进行糖尿病确诊检查[5]，因此糖化血红蛋白水平的检测对于糖尿病的预防及长期控制糖尿病患者血糖状态至关重要[6]。目前测定糖化血红蛋白水平有若干方法，包括电泳，离子交换色谱法，高效液相离子交换层析（HPLC），硼酸亲和层析，免疫分析，和液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS），生物传感器等等，其中，HPLC已被国际临床化学和实验医学联合会（IFCC）作为检测糖化血红蛋白的标准参考方法之一。本文将采用一种新的分离方法，毛细管等电聚焦凝胶电泳（cIEF）分离检测HbA1c，确定糖化血红蛋白比率。20mmol/LNaOH（阴极电解液）和20mmol/LH2SO4（阳极电解液）形成稳定的pH梯度[7]，含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶可使凝胶毛细管等电聚焦电泳（Gel-cIEF）在窄PH梯度下[8]，对血红蛋白有显著的分离，直接进行微型毛细管等电聚焦电泳[9][10]，分离血红蛋白[11]，获得糖化血红蛋白比率。并与高效液相离子交换层析（HPLC）法进行比较。Gel-cIEF方法不受变异体影响，且特异性好，可作为HPLC的一种替代方法应用于糖化血红蛋白的标准检测，为糖化血红蛋白的快速检测提供了一个新的可靠的方法1材料与方法1.1原料1.1.1实验标本血液样品由上海瑞金医院提供，随机挑选已确诊的糖尿病病人30人，健康志愿者16人，抽取2mL静脉血，标本中加入1.5mg/mLEDTA-K抗凝，并在采集后12h内进行检测；同时随机挑选已检测到含有蛋白变异体E的血液样品7例。血样样品的采集及分析均符合操作标准和医院伦理条例1.1.2主要仪器设备丙烯酰胺（超级纯99.9%）购自阿拉丁试剂公司（上海）；N.N-亚甲基双丙烯酰胺，过硫酸铵（APS）和N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）购自Sigma公司；Bio-LytepH6-8载体两性电解质购自Bio-Rad公司；HPLC法使用的是Bio-Rad的配套试剂：全血灌注液（REF270-0350**），洗脱缓冲液A（REF270-2110NU**），洗脱缓冲液B（REF270-2111NU**），清洗液（REF270-2112NU**），分析柱（REF270-2113NU**），校准品/稀释液组合（REF270-2115NU**）及质控品（REF740），质控品包括HbA1c高（9.6%）、低（5.1%）值水平的全血溶解冻干品，对整个检测全程进行质控，含色谱分析软件参数的CD光盘（REF270-2114NU**）。1.1.3主要仪器设备Bio-Rad公司全自动糖化血红蛋白分析仪VariantII；无聚合物涂层石英毛细管（内径600μm，外径1200μm）购于瑞普有限公司（河北）；szx7立体显微镜的集成系统（Olympus，日本）和EXCCD（Touptek，中国）；电源（DYY-4C）购于北京六一科学仪器厂）1.2方法1.2.1凝胶毛细管等电聚焦（Gel-cIEF）方法测定1.2.1.1血液样品的前处理将随机血液样品4℃，2000r/min离心10min后，除去血浆。用等渗盐水（0.9%生理盐水）洗涤三次；加等体积的超纯水和0.4mL四氯化碳除去膜碎片；4℃，9000r/min离心10min，四氯化碳萃取分层，由上至下分别为血红蛋白的水溶液，四氯化碳层，脂溶性物质的沉淀层，红细胞破碎物沉淀；吸取上清血红蛋白溶液，一氧化碳饱和，防止血红蛋白氧化。1.2.1.2凝胶毛细管等电聚焦分离血红蛋白采用实验室自主研发的小型化毛细管阵列装置分离血红蛋白。利用直接灌入含2%Bio-lytePH6-8两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶（5%T，4%C）的毛细管作为样品的分离通道。每根毛细管加载样品2μL；20mmol/LNaOH为阴极电解液、20mmol/LH2SO4为阳极电解液；电压60V/cm2min，100V/cm2min，150V/cm2min，恒定电压400V/cm2min；在紫外吸收峰415nm处检测各血红蛋白成分。获取分离图像，毛细管电泳仪数据处理软件进行峰处理最终确定HbA1c值。1.2.2高效液相色谱（HPLC）方法测定糖化血红蛋白分析仪VariantII采用高效液相色谱法（HPLC）的工作原理。首先用Bio-Rad公司的VariantII糖化血红蛋白分析仪配套校准品（REF270-2115NU**）及HbA1c高、低值水平质控品（REF740）校正仪器，然后测定样品中的HbA1c值。抗凝全血标本放置于试管架上，样品在VariantII的样本仓（VSS）自动混合和稀释后（5μL血液样品由VariantII配套稀释液稀释到1.5mL），注入分析柱。VariantII色谱仓（VCS）的双泵将预先设置的递增的离子浓度的缓冲液注入分析柱，血红蛋白通过与柱中填料离子现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.1286间的相互作用而分离。分离的血红蛋白随后通过流动池，用415nm滤光片测量各个血红蛋白成分，690nm的滤光片校准背景吸收。VariantII临床数据管理（CDMTM）软件分析。每个样本的分析时间为3min。1.2.3统计学处理SPSS17.1统计软件对高效液相色谱法及毛细管等电聚焦方法分离所测结果（同一样品三次重复检测）进行分析，以高效液相色谱法测定值为X，毛细管等电聚焦方法测定值为Y，比较方法计算线性回归方程Y＝a+bX及r值。1.2.4血红蛋白变异体HbE干扰影响测试HPLC方法易受血红蛋白变异体干扰，从