间接免疫荧光试验11.12

间接荧光免疫实验2013307341叶苹苹一、原理根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。二、常见荧光素特性1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。4）镧系：Eu、Tb5)PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。6）其它：酶作用后产生荧光物质。三、分类直接免疫荧光法间接免疫荧光法四、应用将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制，待病价最高的时候进行间接荧光免疫实验用于分毒时，确定有无病毒的存在测抗体五、优缺点及注意事项优点：特异性高、敏感性高、速度快缺点：非特异性染色注意事项：1、每次试验应设阳性和阴性对照2、应注意荧光抗体的质量3、标本应避光保存六、操作步骤1、病毒吸附：5%cpv同步接毒，3d2、丙酮固定：80%丙酮，4℃,1h3、洗涤：用PBS洗涤3遍∕3min4、加入一抗：加入抗CPV阳性血清（1：100倍稀释），200μL/孔，37℃湿盒中作用3h5、洗涤6、加入二抗：加入FITC标记羊抗鼠IgG二抗（1:300倍稀释）50μL，37℃闭光作用1h；7、洗涤8、镜检：荧光显微镜观察，拍照，有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。七、图示