细胞发展

刘金涛E-mail:[e-mail]华东理工大学海正研究院动物细胞与组织工程研究所MammalianCellCultureContentsAntibodyproductionMetabolismofcellCellculturemediumCelllinesHistoryofcellcultureDevelopmentofCellCulture•细胞培养指:从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖，培养过程中细胞不再形成组织。发展与完善细胞培养技术围绕以下几个方面进行：防止污染改进培养方法设计新型培养容器设计不同的培养基等。Typicalapplicationofmammaliancellculture1、cellbiologyresearch细胞生物学研究2、toxicitytesting毒理实验3、productionofcomplexproteins蛋白生产4、productionofvaccines疫苗生产5、tissueandorganculture组织和器官培养6、mostfrequentproduct：monoclonalantibodiesfordiagnosticsandtherapy生产诊断和治疗的单抗Nomenclature原代培养：（primaryculture）首次分离组织的培养。细胞系（cellline）：原代培养物经传代成功。有限细胞系：不能继续传代或者传代次数有限（50代）连续细胞系：可以连续传代细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。TheGrowthTypeofCell按生长方式贴壁依赖型细胞（anchorage-dependentcell）悬浮型细胞（Suspensioncell）贴壁细胞成纤维型细胞（Fibroblast-likedcells）上皮型细胞（Epithelium-likedcells）游走型细胞CellTypeContentsAntibodyproductionMetabolismofcellcultureCellculturemediumCelllinesHistoryofcellcultureNormalcell•正常细胞：正常的原代培养物进行传代形成的继代培养物增殖能力有限，最多只可传50代左右。四个特征1.无明显的基因突变2.有限的寿命3.细胞无恶性4.贴壁依赖贴壁依赖性细胞必须全部符合，悬浮细胞必须符合前三个Transformedcell培养过程中自发转化化学转变病毒转化致瘤因子转化转化细胞：正常细胞在培养过程中获得无限增殖的能力，成为连续细胞系四种途径：转化细胞伴随着染色体模式的改变，二倍体变成异倍体TumorCell•来自于肿瘤组织的细胞或者经肿瘤组织与其他细胞融合产生的细胞•与转化细胞相比它们是恶性的，常常是非贴壁依赖性的。CellLineHuman293A549CEM-AHelaS3Hs68MRC-5WI-38324-KH9HEL299HT-1080MarmosetB95-8Murinebalb/3T3L929NIH/3T3K-BALBSC_1BovineMDBKBTFBLMonkeyVEROCV-1FRhK-4BS-K-1RatXCMRK-49FPorcinePT-1PK15STHamsterBHK-21CHOMinkMiCLMv1LuEquineNBL-6FelinePG-4CanineMDCKSheepMDOCKInsectSF9CommonlyusedcelllinesCelllineOriginCelltypeCommentBHKBabyhamsterkidneyFibroblastAnchorage-dependent/suspension;CHOChinesehamsterovaryEpithelial…..HeLaHumancervicalcarcinomaCancercellMDCKCaninekidneyEpithelialAnchorage-dependentMRC-5HumanembryoniclungFibroblastFinitelifespan,normalcells;NamalwaHumanlymphomaLymphoblast3T3MouseconnectivetissueFibroblastVigorousgrowthinsuspension;WI-38HumanembryoniclungFibroblastFinitelifespannormalcells;VeroAfricangreenmonkeykidneyFibroblastNormaldiploidcharacteristics;ChineseHamsterOvary(CHO)CellChinesehamsterovary(CHO)cells中国仓鼠卵巢细胞•In1957,TheodoreT.PuckobtainedafemaleChinesehamsterandusedittoderivetheoriginalChinesehamsterovary(CHO)cellline•Aglycine-dependentstrain(CHO-K1)wasderivedfromtheoriginalcelllinesSincethen,CHOcellshavebeenacelllineofchoicebecauseoftheirrapidgrowthandhighproteinproduction.ThedevelopmentofCHOcell•1980,CHO-K1wasmutagenizedtogenerateCHO-DXB11(alsoreferredtoasCHO-DUKXorCHO-DUK-XB11),acelllinelackingDHFRactivity•1983,CHO-DG44,acelllinewithdeletionsofbothDHFRalleles•ThesetwoDHFR-minusstrainsrequireglycine,hypoxanthine,andthymidine(GHT)DHFRisasmallmonomericenzymethatcatalyzestheconversionoffolicacid,totetrahydrofolate(THF)GeneticheterogeneityofCHOcelllinesFirstCHOCellGenomeContentsAntibodyproductionMetabolismofcellCellculturemediumCelllinesHistoryofcellcultureCellCultureMedium1.ClassicalMedium经典培养基2.SerumFreeMedium(SFM)无血清培养基3.ProteinFreeMedium(PFM)无蛋白培养基4.ChemicalDefinedMedium(CDM)CD培养基BMEEagle‘sbasalmedium（基础Eagle培养基），1955年由Eagle设计，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等MEMEagle‘sminimumessentialmedium（低限量Eagle培养基），1959年修改配方，是一种最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。DMEMDulbecco‘smodificationofEagle’smedium，DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，分低糖、高糖。RPMI1640RoswellParkMemorialInstitutemedium;Moore等人于1967年，针对淋巴细胞培养设计IMDMIMDM是由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。Ham'sF10,F-121963年、1969年由Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10用于仓鼠、人二倍体细胞，F12适用于CHO细胞ClassicalMediumSerumFetalbovineserum(FBS)胎牛血清1Newborncalfserum(NBCS)新生牛牛血清2Calfserum小牛血清33血清的来源有牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清。最广泛应用的为牛血清，主要是它来源充足、制备技术成熟Functions提供基本营养物质：氨基酸、维生素、脂类物质、核酸衍生物等。提供激素和各种生长因子：胰岛素、表皮生长因子等。提供结合蛋白：如白蛋白、转铁蛋白等提供促接触和伸展因子.Drawbacks成分复杂批与批之间差异很大含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶取材中可能带入支原体、病毒血清的使用使得实验和生产的标准化困难大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵TheCharacteristicsofSerumSerumFreeMedium无血清培养基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分ITES:Insulin,Transferring,EthanolamineandSeleniteTraceelementGrowthfactors1）未知组分少；2）培养基中不存在血清，对培养细胞影响小；3）杂蛋白含量少，生产的产品后期处理较容易。4）可以实现细胞的大规模悬浮培养SFM优点：ProteinFreeMedium•无蛋白培养基（proteinfreemedium,PFM）:即不含有动物蛋白的培养基。•无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清白蛋白等ChemicalDefinedMedium化学成分限定的培养基(chemicaldefinedmedium,CDM):是指培养基中的所有成分都是明确的。它不含有动物蛋白和水解物或未知结构成分，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。例如：CDOptiCHO™CDCHOMediumMediumPropertiesandcomponentscomponents1.Glucose2.Aminoacid3.Vitamine4.Inorganicsalts5.Traceelements6.othersproperties1.pH2.Buffer3.Osmolality4.TemperatureContentsAntibodyproductionMetabolismofcellCellculturemediumCelllinesHistoryofcellcultureGlucose对于连续细胞系，丙酮酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶它们活性很低，导致糖酵解生成的丙酮酸很难进入TCA循环。Glucoseisusedinmostformulationstoprovideanenergysourceaswellasaprecursorforbiosynthesis.Lacticacidisthemajorproductofglycolysis.Inmostculturesonlyasmallproportionofglucoseiscompletelyoxidizedviathetricarboxylicacid(TCA)cycle.GlutamineL-GlutamineisimportantasaprecursorforPeptideandproteinsynthesisaminosugarsynthesis,Purine，pyrimidine，nucleicacidandnucleotidesynthesisprovidingasourceofcarbonsforoxidationGSGen