lncRNA研究策略之：RNA-Pull-Down实验技术

【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNAPullDown实验技术lncRNA研究策略之：RNAPullDown实验技术RNApull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。RNApull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WesternBlot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。1)lncRNA筛选：通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或NorthernBlot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。2)lncRNA确定：通过5'RACE获取lncRNA5'全长，3'RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。3)表达分析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。4)功能研究：功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用RNApulldown、RNA-RIP(RNABindingProteinImmunoprecipitation)、ChIRP-seq(ChromatinIsolationbyRNAPurification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNAtrans和cis作用机制。采用配体指数级富集系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。采用快速预测RNA与蛋白质相互作用与结构域（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向。采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH）2种现有的研究方法的基础上建立起来的。5)表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。染色质重塑：lncRNA表观调控。一.质粒转化、涂板、摇菌1.取JM109感受态细菌80µl，加入1.5mlEP管中，用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。2.冰上静置30min。3.42℃热休克90-120s。4.迅速移至冰上静置2min。5.在超净台内，于上述EP管中加入50µlLB培养基（Amp－），37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。6.菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均匀，37℃倒置培养（过夜12-15h）。7.将37℃培养（12-16h）平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5mlLB培养基（Amp+）的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。二.质粒中提（TIANGEN，DP107-02）1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。2.取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。4.向离心管中加入250µl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5.向离心管中加入350µl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7.向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。9.将吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm离心2min。10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50µl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。三.质粒线性化：本实验使用的酶为Biolabs的重组酶KpnⅠ。酶切后进行跑胶。四.琼脂糖凝胶电泳1.配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、ⅠH2O，少量EB。2.TBE与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。3.滴加少量EB，于锥形瓶中摇匀。4.倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。5.小心拔掉梳子，取10µl样品加入1µl的10×LoadingBuffer缓缓加入点样孔，并在最右边的点样孔加5µlDNAmaker。6.接通电源。7.电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。五.胶回收（TIANGEN，DP214-02）1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3.向胶块中加入等倍体积溶液PC，50℃水浴放置10min左右，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。5.向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。6.重复操作步骤⑤。7.将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。8.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。六.转录以及生物素标记：1.取无RNA酶管，按下表操作：2.取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。3.取出上述操作的EP管，加入2µl0.2MEDTA（pH=8.0）终止反应。4.取1µgBiotin标记的RNA，加入适量StructureBuffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。5.磁珠准备：使用RIPWashBuffer500µl冲洗磁珠3次。6.用50µlRIPWashBuffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。7.过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。8.RIPWashBuffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。9.往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。10.将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIPWashBuffer冲洗3次，1次1ml。11.于样品中加5×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。12.考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。13.将目的条带切下送测序(质谱检测)。问题1：RNA降解可能原因：1）无核酸酶的环境被破坏2）体外转录的RNA探针降解解决办法：1）清洗和使用新开的离心管和试剂等2）RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度问题2：RNA结合蛋白的亲和力不够：可能原因：1）结合缓冲环境没有优化2）裂解不完全3）磁珠用量不足4）RNA探针用量不足解决办法：1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件2）增加裂解液和蛋白上样量的比例3）增加裂解液4）增加磁珠用量5）增加探针用量6）确定生物素和链霉亲和素效率问题3：RNA结合蛋白没有结合可能原因：1）靶蛋白量不足2）缓冲体系不对3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低解决办法：1）增加上样蛋白量2）应用低盐体系3）加入交联试剂问题4：结合的非特异性高可能原因：1）缓冲环境没有优化2）缓冲环境严谨性低3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化解决方法：1）优化孵育时间温度盐浓度等条件2）使用严谨性高的缓冲体系3）调低RNA探针和样品的比例4）提高裂解液的量问题5：WB信噪比高可能原因：1）阳性信号率低2）一抗效率低3）蛋白没有充分溶解解决方法：1）增加二抗的量2）用敏感度的化学发光液3）用细胞裂解液预孵一抗4）增加样品的量5）确定有没有其他可能的结合情况6）增加裂解液用量