CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介

基因编辑技术CRISPR/Cas91987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列CRISPR(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats).2013年之后，研究者们在《science》和《nature》等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。1.CRISPR/Cas系统概述已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR基因座。根据Cas基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas免疫体统分为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶。1.CRISPR/Cas系统概述1.1CRISPR的分布与分类：CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。1.2CRISPR系统获得：1.CRISPR/Cas系统概述2.CRISPR/Cas系统结构2.1CRISPR/Cas主要由两部分组成：2.2CRISPR结构：CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列(spacer)与靶基因进行识别。2.CRISPR/Cas系统结构2.3Cas家族：Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2.CRISPR/Cas系统结构CRISPR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步加工成小的成熟的crRNA.CRISPR/Cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。3.CRISPR/Cas9系统作用机制4.CRISPR/Cas9系统TypeⅡ因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。TypeII系统具有以下特点：在CRISPR/Cas基因座上游会表达tracrRNA;tracrRNA会参与crRNA的加工，这个工程亦需要RNaseIII的参与；tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割。Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。4.CRISPR/Cas9系统Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明,这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA融合体,简称sgRNA(singleguideRNA)4.CRISPR/Cas9系统4.CRISPR/Cas9系统酿脓链球菌4.CRISPR/Cas9系统CRISPRDesignTool::://zifit.partners.org/Cas9Design:::系统gRNA在线设计工具：4.CRISPR/Cas9系统基因敲除或者敲入；基因修复；基因调控；文库筛选。4.CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas作用：5.CRISPR/Cas9脱靶效应2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消除。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。Cas9蛋白不具特异性沈彬，20156.降低脱靶效应Cas9切口酶通过点突变的方法，使Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶YuHisanoetal.20146.降低脱靶效应添加同源臂(homologyarm,HR)NicolasWyvekensetal.2015FoKI-dCas96.降低脱靶效应FengZhangetal.20156.降低脱靶效应CRISPR/Cpf1系统Cpf1系统更简单一些，它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。Cas9切割留下“平端”（bluntends）。Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入。Cpf1切口远离识别位点。Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理