实验-土壤中产淀粉酶菌株的筛选

生物制药学实验实验1-5产淀粉酶菌株的筛选及诱变系列实验实验需知实验分组：2个实验室，每个实验室分6组（名单上报），每次实验结束留1组同学值日实验成绩：占期末总成绩的20%，包括实验出勤、实验操作、实验结果及实验报告撰写实验结束：将实验用品收拾整齐，由实验老师确认实验结束后方可离开实验报告：实验目的、实验原理、实验步骤（注意事项）、实验结果、思考题系列实验内容实验1土壤中产淀粉酶菌株的筛选（1、2）实验2产淀粉酶菌株的诱变剂量选择实验3紫外诱变剂突变菌株的初筛实验4紫外诱变剂突变菌株的复筛实验5高产淀粉酶生产菌株的稳定性及淀粉酶活力测定背景知识淀粉酶（amylase,Amy,AMS）：能水解淀粉、糖原和有关多糖中的O-葡萄糖键的酶药物：助消化药，治疗功能性消化不良背景知识产淀粉酶微生物：细菌、真菌等菌种分离与筛选步骤：采样——培养——分离——筛选诱变育种步骤：诱变——初筛——复筛——性能检测背景知识实验1土壤中产淀粉酶菌株的筛选（1）实验目的掌握菌种分离与筛选的方法从土壤中筛选出能够合成分泌淀粉酶的微生物实验原理自然界微生物种类繁多，有些微生物能够以淀粉作为碳源进行生长繁殖，这是因为它们能够合成分泌淀粉酶。当能合成淀粉酶的微生物在含有淀粉的固体培养基中生长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，使菌落周围的淀粉水解成为小分子量的糊精、聚糖和单糖。这些水解产物不能与碘作用，从而在菌体周围形成透明圈。实验步骤1.筛选培养基的配制（已完成）可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000mL。2.倒平板（每组6个，每个平板10mL左右）实验步骤3.土样的采集各实验室分别取三种不同环境的土样并记录当时取样环境情况（1-2、3-4、5-6每两小组在同一个地方进行取样），通常取离地面5～15cm处的土壤。4.稀释分离取土样1g，加入9mL无菌水，逐步稀释至105、106、107（单数组）或106、107、108（双数组），每个梯度涂2个平板。10ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml10-110-210-710-610-510-410-31ml1ml1ml1ml1ml稀释1ml分离实验步骤5.各组做好标记，置于30℃恒温培养48h（倒置培养？？）6.产淀粉酶菌株的鉴定（下次课）6.产淀粉酶菌株的鉴定倒平皿（注意培养基状态、体积、表面平整）：3个用接种环挑取单菌落到无菌瓶皿上（点植法：用接种环在固体培养基表面接触几点），同时用签字笔按对应顺序对各单菌落进行标号。在原培养皿表面喷洒稀碘液，记录有水解圈的单菌落，与此对应找出合成淀粉酶的菌株1-2株。注意：未分离得到菌落的小组可与其他组合作，挑取其他组鉴定得到的菌落进行后续实验（实验报告中注明使用哪一组的菌落）。7.产淀粉酶菌株的增殖培养液体培养基分装：10ml/瓶，每个菌株对应1瓶（每组1-2瓶，参考鉴定结果）液体培养基接种：用接种环从固体培养基表面上沾取少许菌苔，将接种环在液体培养基内振摇几次即可。做好标记，放入摇床中振荡培养24h。8.产淀粉酶菌株的纯化——平板划线法灼烧接种环，冷却后用接种环挑取少量菌苔左手持平皿，将皿盖打开一条缝隙，右手将接种环伸入皿中，划3-4条平行线灼烧接种环，60°旋转平皿，划线（注意：后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起）灼烧接种环，将划线平板倒置，于30℃培养48h后观察。实验结果及分析1.取样环境情况2.记录产淀粉酶菌株数量（比透明圈？？）及对菌落的初步鉴定结果3.分析：从不同地点获得的结果为什么会出现差异？可以初步得出什么样的结论？（未分离出菌株的原因？）细菌菌落特征较湿润、光滑、透明、易挑取菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致质地均匀、小而突起（或大而平坦）有臭味或酸败味酵母菌菌落特征（与细菌相似)圆形或卵圆形较湿润、较粘稠、光滑，易挑取菌落质地均匀正反面、边缘和中心颜色一致比细菌菌落大而厚，较不透明，颜色多呈乳白色多带酒香味霉菌菌落特点大而疏松，呈绒毛状（曲霉）、絮状（毛霉）、地毯状（青霉）或蜘蛛网状（根霉）有的无固定大小，延至整个培养基中产色素，使菌落显色放线菌菌落特征干燥、不透明，小而紧密，呈放射状菌落初期表面光滑或呈致密的丝绒状，当产生孢子之后，其菌落表面呈粉状、颗粒状菌落和培养基连接紧密，难以挑取，或者整个菌落被挑起而不致破碎菌落颜色多样，菌落正反面颜色常不一致带有泥腥味思考题1.为什么要用淀粉作为碳源？2.为什么同一个土样要稀释不同梯度进行涂平板？实验报告本次实验与上次实验合写一份实验报告即可实验报告在本周六实验课时上交注意每次实验课前5分钟由各实验室本次值日小组将实验材料由准备室取出至各实验室中实验结束后请各组同学务必与实验老师处签到后方可离开，否则记为缺勤最后一组同学使用完超净台后，需将台内废液、使用过的枪头等清理干净，移液枪调回最大量程，并用酒精棉球将台面擦拭干净后，打开紫外灯照射。