表面等离子共振技术

表面等离子共振技术SurfacePlasmonResonancetechnology，SPR北京大学基础医学院05级医学实验马吟醒朱倩薛夏沫黄辰[摘要]表面等离子共振技术，英文简写SPR，是从20世纪90年代发展起来的一种新技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片（biosensorchip）上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。本综述主要介绍SPR的历史、工作原理、应用以及研究发展的前景。[完成时间]2008年6月[引言]1902年，Wood在一次光学实验中，首次发现了SPR现象并对其做了简单的记录，但直到39年后的1941年，一位名叫Fano的科学家才真正解释了SPR现象。之后的30年间，SPR技术并没有实质的发展，也没能投入到实际应用中去。1971年Kretschmann为SPR传感器结构奠定了基础，也拉开了应用SPR技术进行实验的序幕。1983年，Liedberg首次将SPR用于IgG与其抗原的反应测定并取得了成功。1987年，Knoll等人开始研究SPR的成像。到了1990年，BiacoreAB公司开发出了首台商品化SPR仪器，为SPR技术更加广泛的应用开启了新的乐章。简言之，SPR是用来进行实时分析，简单快捷的监测DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、药物与蛋白质之间、核酸与核酸之间、抗原与抗体之间、受体与配体之间等等生物分子之间的相互作用。SPR在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测以及法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。[正文]1一、表面等离子共振原理：1.消逝波：根据法国物理学家菲涅尔所提出的光学定理：n1sinθ1=n2sinθ2可知，当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。（图1）当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝波。（图2）图1图22.等离子波等离子体通常指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子波。3.SPR光学原理2我们在前面提到光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质（假设为金属介质）中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。可以从左侧的反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角θ为SPR角。电子吸收光能量，从而使反射光强在一定角度时大大减弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子之间相互作用的特异信号。3二、表面等离子共振仪器结构及工作原理：以瑞典的Biacore3000型SPR仪为例（如图1），介绍这种仪器的构成及工作原理。一、Biacore3000由工作单元和一台安装有BiacoreControl软件的电脑组成。其核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分，其他的组成部分包括LED状态指示器及温度控制系统等。图11、光学系统：能够产生和测量SPR信号的光电组分称为光学检测单元。其利用的BIA技术是基于表面等离子共振(SPR)的物理光学现象的新型生物传感分析技术，由于其不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。SPR共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，折射率的变化（RU）又与结合在金属表面的生物大分子质量成正比，具体1000RU的变化表示传感片表面1ng/mm的质量变化。因此，BlA技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始数据，并经相关处理获得结果（如图2）。用SPR检测器所得的信息可直接来自表面的样品，也可间接来自能与样品特异结合的相关试剂，还可以从粗样品的嘈杂信号中获得微量待测样品的特异性信号。其最低检测下线为pg级(10-12g)。图22、传感器芯片：BIAcore传感器的芯片是其最为核心的部件（图3）。在BIA技术中必须首先有一个生物分子偶联在传感片上，然后用它去捕获可与之进行特异反应的生物分子。它将50nm至100nm厚的金膜固定在一块玻璃片上，将此玻璃片嵌在一个塑料平板夹里，用一种折射率与棱镜匹配的聚合物将芯片耦合到玻璃棱镜上，在芯片表面固定一层较容易与其它生物大分子偶联的葡聚糖分子层（使用者也可以根据需要选择非葡聚糖分子层的芯片）而成。该偶联过程可由仪器全自动控制。4传感芯片又分为三个主要组成部分，分别是光波导耦合器件、金属膜以及分子敏感膜。下面分别介绍各部件作用以及特殊要求：1）光波导耦合器件：产生SPR现象必须将光波与表面等离子体子耦合并使其发生共振，因此就必须使用耦合器件。常用的耦合器件（如图4）主要有棱镜(Otto型和Kretschmann型)、光纤和光栅三种类型，此外还有通道波导等。图4图3a）棱镜：用于产生衰减全反射(ATR)的棱镜型装置有Otto型和Kretschmann型。（如图5）两种装置检测的都是P偏振入射光的衰减全反射，均使用三角形或半球形棱镜。制作棱镜的材料为折射率(ε0)较大的石英或普通光学玻璃，图中kx和ksp分别表示光和表面等离子体子的波矢。对两种棱镜的比较见下表1。Otto型Kretschmann型棱镜与金属膜间隙有无待测物位置ε2（棱镜与金属膜之间）金属膜下方SPR发生界面2/11/2重要影响因素棱镜与金属膜间隙取值金属薄膜厚度应用较少（使用与制作有一定难度）广泛采用优点不需严格控制金属膜厚度对棱镜表面破坏作用小制作使用方便简单图5b）光纤：棱镜耦合的SPR传感器体积较大，不能用于远程传感测量。为解决此问题，可使用单根多模光导纤维作为光学耦合元件省略传统光学棱镜，装置简单价廉，可用于遥测和多路传输。包括两种光导纤维SPR传感装置。一种是在线传输式，另一种是终端反射式。5（如图6）。图6c）光栅：大多数SPR装置采用棱镜耦合入射光，光栅耦合SPR的研究工作显然较少，因为前者相对较简单。其主要原因除光栅在制作方面有一定难度外，在分析应用上也存在一定的问题。光线透过的样品溶液，如果是无色的，影响可能较小。而如果样品溶液是有色的，则将对光产生吸收，从而影响SPR的测量。从理论上分析比较SPR衍射光栅耦合法与棱镜耦合法的灵敏度，发现以波长作为变量时棱镜耦合法的灵敏度高于光栅耦合法，以角度作为变量时棱镜耦合与平面光栅耦合具有相似的灵敏度。但若采用曲面衍射光栅，在测定SPR峰位置变化方面，能获得很高的灵敏度。2）金属膜：金属元素的性质各不相同。因此，选择不同种类金属材料作为构成表面等离子体子共振的基质膜，将会对SPR光谱产生很大影响。SPR研究的是反射光谱，所以需要在可见光范围内考虑反射率较高的金属，其随波长变化而改变的幅度较小，稳定性要好。故Au膜和Ag膜是SPR中最常使用的两种金属薄膜。Au膜的稳定性最好，在SPR中具有重要应用价值，尤其适用于银膜不能使用的体系。另外，金属薄膜的厚度是影响共振深度的重要因素，见图7。随着膜厚度的增加，共振深度变小，最小反射系数变大；当膜厚度超过一定值时，共振峰将消失。当膜厚在某一数值时，反射光强度近似为零，共振深度达到最大。通过实验，一般选择膜厚度为50nm左右，最多不超过100nm。图73）分子敏感膜：为了满足分析各种生物体系的要求，多种传感器芯片应运而生，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞，每一种芯片都必须能提供给科学工作者稳定的基线，高灵敏度，广泛的再生方法，反复使用性和特别好的重现性。63、液体处理系统：（图9）包括两个液体传送泵，其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传感芯片表面，另一个泵负责自动自动进样装置中的样品传送。此外还包括：自动上样装置(autosampler)：负责样品的混合、注射和回收。一体化U型射流器（Integratedu-FluidicCartridge，IFC）：包含液体传送通道，样品环和阀门。四个可探测的液体池(flowcell)：该液体池通过将IFC靠在传感芯片上而形成。传感芯片插入检测单元的芯片盒中，引入（dock）仪器后于IFC共同形成液体池。IFC通过连接块与缓冲液相连。连接块上有注射口，通过注射口可以将样品加载到IFC上。微处理装置(microprocessors)：它能控制泵，自动上样装置，和IFC的阀门并且能对SPR信号作基本的处理。微射流卡盘是一个液体传送系统，通过软件的控制自动地传送一定体积的样品至传感器芯片表面。通过对管道内微型气阀的控制，形成各种液体流动回路，将样品或缓冲液送到传感片表面的不同通道。甚至自动进行样品的回收。（如图10）图9图104、其他部分：包括例如Biacore3000的LED状态指示器和温度控制系统（如图11）等。SPR信号对于温度变化非常敏感，所以在整个实验过程中保持传感芯片表面的温度恒定是非常重要的。Biacore3000采用Peltier元件来控制传感芯片的表面温度。如果温度不稳定，仪器前部面板上的黄色LED会不停的闪烁。通过预先设定，实验者可以把温度控制在4-40℃之间任意一点。在仪器前部面板上有5个LED状态指示器，LED的最显著特点是使用寿命长，光电转换效能高，分别能够显示仪器不同方面的状态。另外，在光源的选择上，固定波长、改变入射角测量方式的SPR装置多采用He2Ne激光器(λ=63218nm)作为光源。用激光器作光源，单色性好，强度高。在部分文献中发光二极管(LED)也作为SPR的光源，选择的波长多为760nm。LED的单色性也较好，且体积小，价格低，使用寿命长。采用固定入射角以波长为变量测量方式的SPR仪器和装置，白炽灯中的卤钨灯是较适合的光源，因为它在可见光区有连续发射光谱，并具有足够的强度和稳定性，强度不随波长而改变，使用寿命较长。7图11二、检测方式1.在实验过程中除光源固定不动外，整个体系通过一个机械装置进行旋转，从而保证入射角不断地变化。这是SPR研究中应用最为广泛的一种装置。显然这种装置比较复杂，因为要使整个实验装置进行旋转。在以测定角度为基础的模式下，也可采用发光二极管作为光源。由于它是点光源，当光照射到棱镜底边金属薄膜上时，光束会发散，即照射在膜上不同区域的光入射角不同。当用光电二极管阵列检测时，可相应地得到不同角度入射光的反射光。虽然这一方法不需要旋转装置，但所测角度有限。使用棱镜型装置，除了采用固定波长改变入射角的模式外，还可采用固定入射角而改变波长的模式。这样既避免了改变角度模式需要转动整个仪器的问题，又克服了用点光源时测量角度有限的缺点。图12是采用固定入射角改变波长工作模式的SPR装置示意图。图12以波长为变量的SPR装置图从光源发出的复色光，经过由2个透镜和1个偏振片组成的平行偏振光管后，变成平行偏振光，以一定的角度照射到棱镜侧面，经折射后光线到达棱镜底部。底部外侧镀有一层厚50nm的金属薄膜，流通池密封在薄膜下面。光线在棱镜与金属界面处发生全内反射，然后从棱镜的另一个侧面折射出去，并通过一个透镜聚焦耦合进入光纤。光纤将信号光传输至光栅和电荷耦合器件(