微卫星位点筛选方法综述

论文综述微卫星分子标记筛选方法综述摘要：微卫星是一种短的串联重复序列(shorttandemrepeat,STR)或简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)。它作为一种重要的分子遗传标记，能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化，被广泛应用于实验动物的研究。本文概述了获得和富集微卫星位点的常用方法。最简便、最省时的方法是从从公共数据库（如Genbank、EMBL、EST数据库等）或已发表的文献中查找到微卫星位点，但只限于已经有序列数据发布的物种；第二种方法是种间转移扩增，即从相近物种的数据库中查找微卫星位点，或使用已有数据发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。第三种方法是从基因组DNA中筛选微卫星位点，其中用于富集微卫星的方法有引物法、磁珠杂交法、尼龙膜杂交法以及分子标记技术法。关键词：微卫星；分子标记；实验动物微卫星（Microsatellite），又称为简单序列重复（SimpleSequenceRepeat,SSR），短串联重复（ShortTandemRepeatSTR），是以少数几个核苷酸（一般1～6个）为重复单位的串联重复DNA序列。微卫星位点广泛分布于真核生物的基因组中[1]，在植物基因组中平均每33Kb存在一个20bp长的微卫星位点，而在哺乳动物中每6Kb存在一个20bp长的微卫星位点[2]。并且SSR的重复次数不同和重复程度不同，使其呈现高度的多态性。微卫星标记共显性的特点使它能够用于研究等位基因，区分二倍体（或多倍体）的纯合体或杂合体，这是AFLP、RAPD等显性标记所无法做到的。另外，微卫星的特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性，方便各实验室间的交流。目前，微卫星标记已被广泛应用到基因连锁与遗传图谱构建、遗传多样性研究、谱系和发育研究、疾病检测以及品种鉴定、亲本分析与个体、纯系检验上。随着微卫星标记在图谱上的丰富,将显现出更大的优势。但微卫星分析中引物的获得需要预先获知核酸序列,其广泛应用受限于从特定的物种中分离微卫星位点的难度和花费。微卫星标记分离最大的困难是引物的获得。同RAPD、AFLP等遗传标记不同，微卫星研究首先需要获知位点的序列信息，以便从重复序列两端侧翼的保守序列中设计引物。因而微卫星引物的开发是应用该技术的关键。目前已知微卫星位点的物种很有限，这是因为微卫星位点的获得需经过克隆、杂交筛选、测序等步骤，因此需花费一定的人力、金钱，这限制了微卫星标记的大量使用。但近年来发展起来的各种微卫星位点富集技术已在一定程度上解决了这个问题。已有的最常用的获得微卫星位点的方法包括：1.从公共数据库中查找微卫星位点；2.遗传距离相近物种间引物转移扩增；3.从基因组DNA中筛选微卫星位点。其中，最方便、最经济的方法就是从已发表的文献中获得微卫星引物，但该法在使用对象上，只限于已有引物开发出的物种，而且引物的数量不会有所增加，只能停留在原有基础上。对于近缘种引物的应用，其适用范围究竟有多大；原物种的微卫星基因座在其他物种间转移扩增时，其多态性如何。这些问题使得在不同物种间共用微卫星引物时，盲目性较大，可指导操作的理论依据不足。最好的途径就是从基因组DNA中筛选微卫星位点并进行引物的开发。1从数据库中查找微卫星位点在上述三种方法中,最简便最省时的就是从公共数据库或已发表的文献中查找到微卫星位点。许多微卫星研究的出发点都是公共数据库，比如从EMBL、Genbank或EST数据库中查找微卫星位点。从这些数据库中，可通过电子查询方式方便地获得所需要的序列或寻找已存在的微卫星引物。研究者对大量序列进行处理，利用ClustalW等程序，根据相似性程度，剔除冗余的EST，再剔除过短的序列（小于100bp）和过长的序列（大于1000bp），再利用SSRHunter等软件搜索获得含有微卫星的序列，并根据其侧翼序列设计引物。何蔚[3]等选用前人分离得到的42对大熊猫微卫星引物，分别用圈养大熊猫的血液DNA和野生大熊猫的粪便DNA对其进行PCR扩增，结果表明不同标记的多态性差异较大，并筛选出13对能较好地应用于大熊猫遗传多样性研究的微卫星引物。匡刚桥[4]等利用生物信息学方法从公开发表的鳜鱼GenBank数据库中寻找多态信息含量丰富的微卫星位点中共搜索到304条鳜鱼核酸序列，经计算机筛选和人工选择,最终获得22条含微卫星重复单元的序列，利用SSRHunter软件在此22条含有微卫星的序列中发现30个微卫星位点，设计出17对引物，其余位点两端序列短无法设计引物。其中13对引物扩增条带清晰，经过多态性分析，最终筛选获得6对多态性微卫星引物。徐玲玲[5]等从资料和GenBank中选取扩增效果好、等位基因多、均匀分布于小型猪18条常染色体和X染色体上的100个微卫星位点合成引物，对封闭群小型猪基因组进行PCR扩增及条件优化，筛选出32个分布于不同染色体且等位基因多的微卫星位点。近年来随着数据库中EST序列的增加，通过数据库搜寻法获得EST微卫星位点的报道越来越多。在此基础上进行SSR引物开发也就成了一种既经济又有效的方法。许新[6]等从杂色鲍cDNA文库中用SSRHunter软件搜索获得173个重复序列，从中设计93对引物，有78对可以扩增，占合成总引物的83.9%，用深圳、汕尾等3个群体中挑选出多态性引物19对，多态性微卫星比例24.36%。石耀华[7]等从马氏珠母贝cDNA文库查找到了268个重复序列，含微卫星的EST数占EST总数的3.48%，设计151对微卫星引物，有130对可以扩增，占合成引物总数的86.09%，其中多态性引物45对，占微卫星总数的34.6%。EST微卫星位于编码区，由于基因序列的保守性，EST微卫星序列比从基因组中筛选的微卫星多态性低。Eujayl[8]比较了小麦EST的微卫星和基因组微卫星多态性，结果发现基因组微卫星多态性（53%）远高于EST微卫星（25%）。从数据库中查找微卫星最大的缺点是只限于已经有序列数据发布的物种。一个替代方法是从相近的物种数据库中查找微卫星位点，或使用已发表的遗传距离相近物种的微卫星标记。2近缘物种交叉扩增获得微卫星引物由于微卫星重复序列和包含引物位点的侧翼序列在物种间具有保守性，所以某一个物种的微卫星引物可以在其相近的物种中使用，用来检测相近物种同源位点的多态性。这样就大大地减少了检测微卫星位点的工作量。微卫星在近缘种之间的通用性已有研究,但在属间应用还不多。根据M.Rossetto[9]对近年来发表文献的总结，微卫星位点可在物种间扩增，其多态性也相当高。Zucoloto[10]等利用密西西比鳄和宽吻凯门鳄的微卫星在其他3种鳄鱼中进行扩增，扩增率均在85%以上。Küpper[11]等使用的环颈鸻微卫星成功地在4种鸻科鸟类中获得扩增，平均扩增率为75%。蔡清秀[12]等从从非洲象31个微卫星位点和5个已知亚洲象微卫星位点中筛选出14个勐养亚洲象的微卫星位点，其中9个多态位点能在185份粪便样品DNA中稳定扩增。孙涛[13]等利用138条人类微卫星引物在黑叶猴中进行筛选，得到了23个具有多态性的微卫星位点。其中有7个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，9个位点存在无效等位基因现象，但是各位点之间均未检测到连锁不平衡现象，这些位点将在黑叶猴种群遗传结构的研究中发挥重要作用。洪艳云[14]等选用10对非洲糜羚微卫星引物和10对绵羊微卫星引物作为筛选普氏原羚基因组DNA微卫星位点的引物，结果发现20对引物中有8对引物在普氏原羚基因组DNA中扩增出了多态性位点。谭元卿[15]等利用小鼠微卫星位点引物536对，对长爪沙鼠基因组DNA扩增出了313个阳性条带，经测序分析确定130个长爪沙鼠的微卫星位点，与小鼠同源性为24.3%。引物跨物种共用的有效程度除与其亲缘关系的远近有关外。Primmer[16]等对大量鸟类微卫星交叉扩增研究的数据进行总结后提出，交叉扩增中微卫星在来源物种中的完全重复单元数目(perfectrepeatunits)与交叉扩增所获得的同源微卫星位点的多态性呈正相关。微卫星位点的重复单元数目越多，其多态性也就越高，这表明微卫星位点的高重复单元数目在其近缘物种仍有所保持。这意味着即使由于较远的亲缘关系使物种间交叉扩增率较低，具有较高重复单元数目的原始微卫星位点仍有可能获得有价值的扩增产物。值得注意的是，仅从产物片断大小和变化上不是总能很好地确定微卫星的存在，通过改变扩增条件用微卫星引物在物种间扩增得到产物后，仍需要通过杂交、测序等方法确定所扩增出的条带就是所期望的产物。3从基因组DNA中筛选微卫星位点对于无法从上面两种方法获得微卫星引物的物种，可以从基因组DNA中筛选微卫星位点。绝大多数微卫星位点是从100-1000bp的小插入片段基因组文库中通过寡核苷酸探针杂交获得的。标准的分离微卫星位点的方法有如下步骤：①提取基因组DNA；②用限制性内切酶将基因组DNA切割成小片段；③凝胶电泳,回收大小100-1000bp的片段；④将回收片段克隆，使用标记探针进行杂交；⑤筛选出含有重复序列的克隆；⑥测序证实重复序列片段的存在；⑦根据重复序列片段两端保守序列设计引物，进行PCR扩增,检验引物的有效性；⑧对小量样本进行预试验,挑选出重复性好，具多态性的微卫星位点。按以上步骤，Srikwan[17]和Munshi-South[18]利用尼龙膜菌落原位杂交法分离出6个泰国树鼩(Tupaiaglis)和5个马来西亚树鼩（Tupaiaspp.）的微卫星位点。魏东旺[19]等从鲤鱼基因组DNA中筛选微卫星位点，用探针(CA)n对质粒pGEM-3Zf(+)构建的基因文库进行杂交筛选，从2000个白色菌落中共获得阳性克隆45个，其中32个克隆中共得到22个微卫星。从基因组文库中分离微卫星位点的传统方法在微卫星富集程度上效率很低，为了提高微卫星位点分离的效率，在文库构建前或构建后发展了一些富集方法。3.1杂交法富集微卫星杂交富集法根据所使用的介质不同可分为三种：磁珠法、尼龙膜法和亲和素超滤离心法。3.1.1磁珠富集法磁珠富集法的基本原理是用生物素标记重复序列寡核酸探针并与基因组DNA酶切片段杂交，再利用生物素与亲和性强的特性，使两者相互作用的稳定性和强度即使在变性、杂交、洗脱等操作过程中也不产生分离，从而完成对重复序列目标片段的富集，建立微卫星富集文库。经过磁珠富集后使获得的具有重复序列片段的效率大幅度提高。目前，链亲和素包埋的磁珠已被广泛应用到各种微卫星富集方法中。磁珠杂交的微卫星富集过程是在文库构建前，一般步骤如下：限制性内切酶酶切基因组DNA，酶切后的DNA片段≤1000bp；接头连接酶切DNA片段；酶切位点和接头作为引物结合位点，进行扩增，增加DNA片段量；生物素标记的互补微卫星寡核酸探针同PCR扩增产物杂交；链霉素包埋的磁珠杂交筛选目的片段；目的片段洗脱、扩增、纯化、克隆；阳性克隆进行DNA测序，设计引物进行PCR分析；多态性鉴定。于颖[20]等通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库，从1200个转化子中获得了353个阳性克隆，随机挑选53个测序，根据测序结果成功设计了18对藏鸡微卫星引物，最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记。袁慧[21]等用磁珠富集法构建了岩原鲤AC重复和GATA重复的微卫星富集文库，阳性克隆率分别为30%和7%左右。对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性克隆测序，共获得61个微卫星序列。朱亮[22]等法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交，捕获200-1000bp含有微卫星序列的DNA片段，克隆构建富集微卫星序列的小片段插入文库然后用PCR法进行筛选，结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆对其中98个进行了测序，并成功设计豚鼠微卫星引物17对。WANG[23]等采用磁珠富集法建立黑斑狗鱼微卫星富集文库，然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二次杂交，得到的阳性克隆为1300个，占87.25%，从中挑出196个进行测序，192（97.96%）个含有微卫星序列。赵亮[24]等为促进大