HRM研究进展及介绍

HRM_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法•高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定量新技术。•常规Real-timePCR利用SYBRGreen染料标记DNA双链，但是SYBRGreen是一种大分子即不饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。•HRM采用新型的饱和染料如LCGreen，SYTO9等。不仅没有不饱和染料的缺点，而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。•方法•在PCR反应前将LCGreen饱和荧光染料与PCR反应体系混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或Rotor-Gene6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。•原理•HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。•条件要求•1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C，这样就无法保证HRM分析结果的准确性。•2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲线才有了更高的分辨率。HRM在分子诊断中的应用•基因分型•突变扫描•甲基化分析•序列配对•基因分型•传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。•HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中得到应用．人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解酵素和MGMT启动子区域的甲基化．微生物基冈有：hsp65、16srRNA基因、gyrA等．•SNP相关研究方法比较：•目前突变/SNP的研究手段大致有三大类，•一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP，昂贵。•第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已知SNP。结果不稳定。•第三类方法中包括测序、Pyrosequencing等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP分析；Pyrosequencing技术它既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及大规模的等位基因频率测定。HRM主要特点•高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的SNP检测手段：快速、高通量—LightScanner5分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，20000个SNP/天准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner100%准确性、特异性（400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（400~1kb）重复性好—LightScanner重复性100%费用低—LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型•突变扫描•目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C-kit、乙酰辅酶A脱酶的中链、原肉毒碱缺乏症、RET、表皮生长因子受体EGFR、K—ras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿性纤维化基因的几个外显子等等．•甲基化分析•HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样，原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲基化模板的Tm要低。NucleicAcidsResearch,2009,Vol.37,No.12•序列配对•有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因型．表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。需要对HLA进行基因分型．这个主要牵涉到HLA-A，B，C和DR等几个位点．当两个个体的熔解曲线完全相同时就说明HLA基因型完全匹配．•HRM新技术的介绍•1、未标记探针HRM•在HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针，由原来的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针两部分组成的模式。•2、弹回探针•弹回探针(snapbackprimer)是在引物末端加一个与靶片段的突变区域互补的尾巴序列，反应体系是不对称PCR(asymmetricPCR)，带有弹回探针的引物为过剩引物(excessprimer，EP)，另一条引物为限制引物(1imitingprimer，LP)。扩增反应前几个循环为双链扩增，15个循环左右后为单链扩增。熔解曲线区域包括PCR产物区与探针区，通过对探针区的熔解曲线进行基因分型、突变等分析ClinicalChemistry54:101648–1656(2008）•Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP（脱氧核糖核苷酸），若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。•PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比THANKS!