苏云金芽孢杆菌

本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。苏云金芽孢杆菌杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从该菌株或代谢产物中分离纯化了多种辅助蛋白，如P19、P20、P21蛋白以及多种营养期杀虫蛋白。同时，苏云金芽孢杆菌制剂具有一些独特的优良特征。包括经几年储存仍保持稳定、晶体可耐受太阳光的紫外线照射。最重要的特征是，在全球近30年的使用过程中，苏云金芽孢杆菌制剂被证实是安全的。目前，苏云金芽孢杆菌制剂广泛用于粮食、经济作物与蔬菜、林业以及一些卫生害虫的防治。它的另一突出优点是选择性强，对人畜、天敌、植物都非常安全。但也有些不足，如杀虫作用不持久，田间防治效果仅能维持3、4天；杀虫谱偏窄，仅对部分鳞翅目害虫有效；常年使用害虫可能产生抗药性。随着对其作用的分子机理的大量研究以及近年来基因工程技术的发展，通过遗传学方法对苏云金芽孢杆菌进行改良，获得了有价值的苏云金芽孢杆菌新菌株。选择性质粒改造许多苏云金芽孢杆菌菌株的菌体内含复合质粒，大多数这样的质粒可以携带一个或多个cry基因（苏云金芽孢杆菌的主要杀虫晶体蛋白基因），任何cry基因的表达水平都受其它cry基因表达的影响。有时，一个cry基因编码对特定靶害虫具有高活力的原毒素，而另一个cry基因编码对该害虫具有低活力的原毒素，在这种情况下，可以通过除去编码低活力原毒素蛋白基因来实现。以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌株HD-1为例，该菌株含有一个携带编码对鳞翅目专一的135kDa晶体蛋白基因的67kb质粒，以及携带一个编码其他晶体蛋白基因的174kb质粒。小心的进行热激诱导或反复接种培养，会导致质粒在细胞分裂期间发生分离，产生缺失部分或全部质粒的变异种。失去174kb质粒的HD-1突变株，会高表达保留下来的67kb质粒编码的135kDa晶体蛋白原毒素。通过接合构建新菌株苏云金芽孢杆菌菌株的特定质粒可以自行转移，这些质粒可以通过接合来构建新菌株。例如，科罗拉多马铃薯甲虫（鞘翅目）是北美最具破坏性的马铃薯害虫，欧洲玉米螟和土豆块茎蠕虫，对马铃薯也有很大的破坏作用。从自然界中分离的苏云金芽孢杆菌菌株，没有一个菌株对所有这些昆虫都具毒性。然而，通过质粒转移杂交，现在已经构建出对三种害虫都有效的新菌株，田间试验表明该菌株作为广谱的马铃薯杀虫剂很有前途。cry基因向其它生物体转移利用基因工程技术，任何生物体都可以获得并表达cry基因以及进行相关的修饰。目前，cry基因已经被转移到不同的细菌和植物中并高效表达，另外，将cry基因转移到在水生环境中茂盛生长的蓝细菌中，可以使蚊子聚集的环境保持高水平的毒素。这种类型的基因转移对作物保护和致病昆虫的抑制提供了新思路。对苏云金芽孢杆菌进行遗传改良，达到扩大杀虫谱和提高杀虫毒力的目的，并在此基础上分别构建了对棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等害虫高效的工程菌，已进入田间试验阶段。另外还有一些芽孢杆菌也可以用作农业杀虫剂，如球形芽孢杆菌、金龟子芽孢杆菌，等等。昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒也是一类重要的、较早应用的昆虫病原微生物。昆虫感染病毒很常见，杆状病毒科的宿主范围限定在一小部分节肢动物昆虫、一些甲壳类和螨类，然而，敏感昆虫包括许多害虫。杆状病毒占所有已知感染昆虫病毒的60％以上，它们对脊椎动物和植物不具致病性。目前至少已有600多种昆虫（主要是鳞翅目昆虫）和其它无脊椎动物中发现杆状病毒感染，并常常在引起昆虫流行病，也是调节昆虫种群密度的重要病原因子。杆状病毒的重要特征之一就是在其生活史的某一阶段，产生包含体，病毒粒子包埋于包含体的蛋白基质中。敏感幼虫吞食了污染病毒包含体的食物会导致昆虫感染，病毒包含体在宿主消化道碱液中崩解，释放出病毒颗粒，病毒颗粒进入宿主的肠上皮细胞。宿主死亡和分解后，包含体可以较长时间保护病毒使之不失去感染力，当包含体被其它幼虫吞食后，疾病可在昆虫群体中传播。作为微生物杀虫剂，杆状病毒具有优异的性能。杆状病毒的宿主范围很窄，他们对其他非目标昆虫的影响很小。效果良好，在虫害发生前期使用防效达99%以上。杆状病毒产生的包含体具有侵染性病毒颗粒，对环境的生物稳定性起重要作用，使得利用传统技术去制造和应用病毒更容易。作为昆虫专一性的病原微生物，对人畜、天敌、环境安全，是生产有机食品必不可少的生物农药，其市场前景看好。从1985年国家投资在湖北蒋湖农场建立我国第一个棉铃虫病毒杀虫剂工厂以来，已有多种病毒杀虫剂研制成功，并进人批量生产，在发展“无公害”蔬菜生产中发挥了重要的作用。当然，此类微生物农药也有缺点。病毒杀虫剂比化学杀虫剂更昂贵；许多杆状病毒具有高度的宿主特异性，因此它们只能进行选择性害虫的控制，而多数植物却同时受多种不同鳞翅目害虫攻击；杆状病毒杀虫的速度慢，宿主吞食病毒4~6天后才死亡，其间的大多数时间幼虫仍继续破坏作物；另外，若将杆状病毒用传统的喷雾技术喷到植物叶子上，在紫外线照射下很快就会失去活性。上述这些因素制约了杆状病毒作为害虫杀虫剂的更广泛应用。因此需要通过基因工程技术对它们进行改良。生产人们希望的广宿主范围的品系是完全可能的，一种来自苜蓿拟尺蠖的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，已知的宿主范围包括鳞翅目11科中的43种，决定杆状病毒的宿主范围和毒性的因素还在研究之中。杆状病毒基因工程的技术路线是，去除某些不影响病毒复制和感染的基因，在其强启动子后面插入能增强杀虫毒力的外源基因，如利尿激素基因、Bt杀虫蛋白基因、蝎神经毒素基因等。工程病毒对害虫致病时间可缩短25％~40％，进食量可减少30％~50％，防治效果明显改善。近年研究较多的基因还有在侵染早期表达的蜕皮类固醇UDP-葡萄糖基转移酶基因egt和在侵染后期表达的蜕皮转录因子基因CHR3。egt的缺失或基因CHR3的大量表达可使害虫迅速蜕皮和停止取食而死亡。还有学者提出让杆状病毒建立对紫外线诱导的损伤更为有效的DNA修复系统，来降低病毒对紫外线的敏感程度，增强杀虫能力。昆虫病原真菌对害虫也具有广泛的寄生性和致病性，但因其遗传背景复杂、杀虫分子机理和遗传改良的研究较昆虫病原细菌和病毒相对滞后。值得一提的是，这方面的研究已有显著进展，如StLeger等已从绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）中分离出一种类似枯草杆菌素的蛋白酶，在工程菌中高表达后使烟草天蛾的食量减少了40％，死亡时间加快一倍以上。许多化学杀虫剂对环境具有不利影响，对人类的健康形成了巨大的威胁，因此不得不减少对化学杀虫剂的依赖，施用时进行更加规范的控制。而且许多害虫对广泛使用的化学杀虫剂产生了抗性。基因工程技术的应用为农业微生物遗传改良与各类微生物杀虫剂的开发开辟了新的途径，目前的研究已经显示了这项技术发展的巨大潜力。应用基因工程技术生产和修饰改造这些生物杀虫剂，对微生物制剂用于虫害治理开创了新局面。（王洪斌）