细胞迁移实验技术之细胞划痕实验

细胞迁移实验技术—划痕实验细胞迁移划痕实验基本原理细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定的时间，然后取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力实验材料1、细胞培养平板，一般使用6孔板，大小合适，便于划线和观察；2、marker笔，用于观察是标记；3、直尺，用于观察时对细胞划痕宽度测量；4、20微升枪头（灭菌）或者经过灭菌处理的牙签均可，用于在单层细胞上划痕；5、无血清培养基6、PBS实验步骤：1、培养板划线首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。划线时注意线不要太粗2、铺细胞在孔中加入约5×105个细胞（不同的细胞数量有所不同，根据细胞的生长快慢调整），接种原则为过夜后融合率达到100%。3、细胞划线第二天用枪头或者无菌牙签，垂直与细胞平面，沿着投一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。4、洗细胞划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，-1--2-是划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。5、细胞培养、观察将细胞放入37℃5%CO2培养箱，培养。然后在适当的时间点，如0，6，12，24h取出细胞，显微镜线观察并测量划痕的宽度，并拍照(具体时间依实验需要而定)。6、结果分析使用ImageJ软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。主要事项：1、铺细胞最好使用6孔板，因为6空板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。2、如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。3、照片拍完之后，可以用imageJ来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。4、虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。划痕法测量迁移的不足之处：1、适用的细胞范围小，一般只能适用于上皮细胞、纤维样细胞划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为：（1）这些细胞本身有迁移能力，且较强；（2）细胞有极性，方便测量，观察；（3）细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的。