结核感染T细胞斑点检测试剂盒(免疫斑点法)主讲单位静海县医院主讲人张厚亮1.OxfordImmunotec公司简介2.试剂盒研制的临床背景与技术背景3.试剂盒设计思路与主要原材料研究4.试剂盒分析性能评估5.试剂盒生产与质量控制6.试剂盒国外上市及应用情况汇报内容•公司成立于2003年,依托牛津大学科研技术开发新产品•基于T细胞检测的技术平台最先获得认可•拳头产品:T-SPOT®.TB在欧洲、美国、加拿大和其它地区正式上市OxfordImmunotec公司简介Above:UKheadquartersAbingdon,OxonBelow:USheadquarters,Marlborough,MA结核病——全球关注的问题全球•20亿人口感染结核•新增活动性结核病人约900万/年•每年130万患者死亡中国•450万活动性结核病人•新增活动性结核病人约145万/年•死亡人数约13万/年1.1、试剂盒研制临床背景活动性结核与潜伏感染接触活动性结核病患者暴露程度不足,结核杆菌被机体免疫力清除-没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测-X-光/CT扫描显示正常-没有抗体应答-诊断困难-传统的结核感染检测只有TST(PPD)机体被感染受机体免疫力抑制没有临床症状终身处于感染状态潜伏感染有临床症状具有传染性-结核杆菌可以通过涂片、培养检测出-胸部的X-光或CT扫描显示异常-肺外结核难以诊断(特别是儿童)活动性结核5%5%再次激活控制结核的关键早发现早治疗结核病的常规诊断方法(1)细菌学检查是结核病诊断的金标准,但涂片阳性率低,培养又耗费时日(2)分子生物学检查虽然快速、灵敏,但操作烦琐、技术要求高(3)结核抗体诊断诊断价值有限,但其简便、快速,可以作为结核病的辅助诊断方法之一(4)PPD(TST)实验传统的结核感染检测方法,对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果,对于使用激素或免疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果•γ-干扰素释放实验(IGRAs,interferon-gammareleaseassays)•酶联免疫斑点技术(ELISPOT,Enzyme-LinkedImmunoSpotassay)•结核杆菌特异抗原早期抗原靶6(ESAT-6,earlysecretedantigenictarget6)培养滤液蛋白10(CFP10,culturefiltrateprotein10)1.2、试剂盒研制技术背景γ-干扰素释放实验(IGRAs)TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素γ干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性•结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子(IFN-γ)。因此,检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。•由于效应T细胞存活时间很短,而且具有特异性,因此可以作为机体是否正处于被感染的指标,无论是否有临床症状。•基于IGRAs原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等国家写入本国的结核诊疗指南中γ-干扰素释放实验(IGRAs)•1983年,在南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立地创立了这项技术。•一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth,牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的JonathonD.Sedgwich(SedgwickJDet.al.,1983)。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg,带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者CecilC.Czerkinsky(CzerkinskyCCet.al.,1983a)。酶联免疫斑点技术(ELISPOT)•近二十多年来,随着抗体制备、PVDF膜材料等技术改良,ELISPOT分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术•藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹,ELISPOT分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数:抗原特定T细胞的clone族群大小和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2•结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术,能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况,灵敏度高。•其技术原理,可一句话概括为:用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色方式将其表现出来(SedgwickJD2005)。酶联免疫斑点技术(ELISPOT)酶联免疫斑点技术(ELISPOT)•由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白•所有的卡介苗(BCG)均丢失该基因序列•绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区结核杆菌特异抗原ESAT-6与CFP10抗原结核杆菌特异抗原TuberculosisComplexAntigensEnvironmentalStrainsAntigensESAT-6CFP10ESAT-6CFP10M.tuberculosis++M.abcessus--M.africanum++M.avium--M.bovis++M.branderi--BCGsubstrainM.celatum--gothenburg--M.chelonae--moreau--M.fortuitum--tice--M.gordonae++tokyo--M.intracellulare--danish--M.kansasii++glaxo--M.malmoense--montreal--M.marinum++pasteur--M.oenavense--M.scrofulaceum--M.smegmatis--M.szulgai++M.terrae--M.vaccae--M.xenopii--•采用γ-干扰素释放实验原理,依靠结核特异抗原保证效应T淋巴细胞的特异性•结合酶联免疫斑点技术的特性,提高检测灵敏度2.1、试剂盒设计思路•采集样本(外周抗凝全血)•密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMCs)•洗涤PBMCs检测过程•把PBMCs与结核特异抗原一同加入到预包被抗γ-干扰素抗体的培养孔中•37℃孵育16-20小时检测过程•洗涤培养孔•加标记二抗•孵育1小时检测过程•洗涤培养孔•加显色液•用蒸馏水终止反应检测过程1个斑点=1个效应T细胞检测过程阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照(PHA)实际效果图2.2、试剂盒主要原材料研究•试剂盒主要组成成分1.结核杆菌特异抗原(ESAT-6、CFP10)2.植物血凝素(PHA)对照抗原3.预包被的培养板、标记二抗、底物显色液2.2、试剂盒主要原材料研究(续)结核特异抗原(ESAT-6、CFP10)•通过外购混合多肽合成ESAT-6(PanelA有17个肽段)和CFP10(PanelB有18个肽段)•混合多肽由15个氨基酸片段叠加衍生形成,来源于结核分枝杆菌RD1基因区域•多肽由Pepceuticals(UK)、AdvancedChemtech(US)和BachemUKLTD.(UK)提供•多肽由人工合成,记录其氨基酸序列资料,多肽纯度HPLC检测≥70%和色谱仪检测信息2.2、试剂盒主要原材料研究(续)植物血凝素(PHA)对照抗原•植物血凝素PHA,刺激T淋巴细胞有丝分裂分泌γ-干扰素。作为阳性对照使用(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)•PHA是一种植物凝集素,作为原料溶解于PBS中(5mg/ml),用AIM-V稀释制备(15μg/ml)•植物血凝素PHA在检测中作为一个评价PBMCs活性的指标。2.2、试剂盒主要原材料研究(续)预包被的培养板、标记二抗、显色液•采购自瑞典Mabtech公司的半成品试剂盒(MabtechAB,Stockholm,Sweden)由供应商进行测试并附有合格文件。•包被板:反应孔底部的膜用1.5μg/孔的小鼠抗人γ-干扰素单抗包被。•标记二抗:碱性磷酸酶标记的小鼠抗人γ-干扰素(100ug/ml)单抗(MabtechAB)。工作浓度为0.5μg/mL。(200倍稀释)•显色液:底物试剂为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP,0.692mMol/L)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT,0.734mMol/L)。有色颗粒沉淀形成于反应孔底部的膜上,由BCIP的水解和NBT的还原反应形成。2.2、试剂盒主要原材料研究(续)3、试剂盒分析性能评估项目结果分析灵敏度0.05IU/ml分析特异性不存在交叉反应检测范围定性检测结核特异效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素Cutoff值≥6(斑点数)批内不精密度CV值6.57%-17.13%:中等范围斑点数(71.17+8.47)批间不精密度平均CV值为12.12%:中等水平斑点数,稳定性2-8℃保存12个月•研究方案:用γ-干扰素浓度作为标准评价检测下限,制作灵敏度曲线。•研究过程:得到一条灵敏度特性曲线(0-30ngIFN-g/mL)。•研究结论:配对抗体能够检测细胞因子分泌的γ-干扰素最低含量1ng/ml(0.05IU/ml)3.1、分析灵敏度•T-SPOT.TB使用经过分离和洗涤的外周血单个核细胞(PBMCs)。这点确保全血、血浆或血清中的潜在干扰或交叉反应物质均被清除。细胞因子,由白细胞分泌的,包括IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12,TNFα,IFN-a,和IFN-b,用T-SPOT.TB检测抗体的交叉反应。•研究结论:试验的特异性不受因被测的细胞因子产生的交叉反应影响。3.2、分析特异性T-SPOT.TB的精密度通过重复检测145例临床样本来确定•批内差•通过比较同一个操作人员在同样的板子的实验结果进行。由3个操作者完成9块板子的检测,统计CV值。在高斑点数(210.40+11.59)的结果中,CV值的范围为2.21%-5.7%;中等范围斑点数(71.17+8.47)的结果中,CV值的范围为6.57%-17.13%;在临界值附近的结果中,CV值的范围为19.73%-30.55%。•批间差•通过3个不同的操作人员用同样的3个样本在3个批号的试剂上重复6次试验得到。3个样本结果的斑点数平均为210.40,变异系数CV值为5.51%;接近临界值时的批间差CV值为25.03%;中等水平斑点数结果,平均CV值为12.12%。•每批试剂的CV值结果均一致,证明ELISPOT技术的工艺水准是可接受的。•操作人员间差异•采用3个操作人员用3批试剂的各1块板子进行检测来评估其重复性。•评估操作人员间的变异系数CV值为3.64%-6.18%。这是一个良好的重复性结果当重视在实验过程中发生的随机误差,例如细胞记数、细胞混匀和移取时。•批次差异•采用3个操作人员用3个批次的8孔板各1块进行检测来评估其重复性。•在3个生产批次间获得一个很低的CV值2.63%3.3、精密度•临界值确定:采用确定是阳性或阴性的结果通过ROC曲线分析并选择最佳的灵敏度和特异性。•灵敏度值通过检测经培养确诊的结核患者样本87例确定•特异性值通过检测无已知结核暴露史的93例样本得到。•当临界值为≥6个斑点数时:灵敏度为98.9%(86/87),特异性为100%(93/93)。3.4、临界值ROC曲线ROCPlot00.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.10.20.30.40.50.60.70.80.91Falsepositiverate(1-Specificity)Truepositiverate(Sensitivity).NodiscriminationMax-Neg临界值为≥6个斑点数时的曲线下面积为0.9997显示出非常卓越的鉴别真阳性和假阳性能力。•结核感染T细胞斑点检测试剂盒在52周保质期内实时的稳定性研究•结核感染T细胞斑点检测试剂盒由6种独立试剂成分组成,其中的每一种试剂成分均有自己的保质期限。为了设定失效日期和遵守有关规程,试剂盒整体的稳定性评价采用3个批号的试剂来完成•结核感染T细胞斑点检测试剂盒正常的储藏温度为2-8℃,在产品的整个有效期内都将被储存在此温度范围内•一部分试剂为了稳定性研究被
本文标题:T-SPOT TB
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