3第三章_外植体的选择和灭菌

第一节外植体的选择第二节外植体的灭菌方法第三节污染原因和预防措施第三章外植体的选择和灭菌第一节外植体的选择1外植体部位2取材季节3器官的生理状态和发育年龄4选取适宜的大小1外植体部位植物体的各个部位，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应不一致的。大多数植物来说，茎尖是较好的部位，其形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，是获得无病毒苗的重要途径。外植体选择的原则培养材料的来源是否保证是否会引起不良变异。叶片的来源最有保证，许多植物的组织培养以叶片为外植体。对一些培养较困难的植物，可以通过子叶或下胚轴来建立其组织培养再生体系。2取材季节在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。3器官的生理状态和发育年龄植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄却较老，更接近发育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，则生理年龄越小。下部组织越易形成营养器官，上部组织易形成花器官。通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。4选取适宜的大小材料太大易污染；材料太小，难于成活。0.5cm--1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小第三章外植体的选择和灭菌第一节外植体的选择第二节外植体的灭菌方法第三节污染原因和预防措施1外植体的灭菌方法预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水中冲洗干净。预处理的植物材料的灭菌：原则：充分灭菌，但不伤外植体不同的外植体，灭菌的要求也不一样2常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间（min）效果次氯酸钠10-30易5—30很好次氯酸钙2易5—30很好漂白粉饱和浓度易5—30很好氯化汞0.01—1较难2—10最好酒精70—75易0.2—2好过氧化氢10—12最易5—15好溴水1—2易2—10很好硝酸银1较难5—30好抗菌素4—50mg/L中30—60较好常规的表面灭菌处理方法①把材料放进70%的酒精中约30s。②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min。或用10%的漂白粉上清液中浸10min～15min。③无菌蒸馏水冲洗3～5次。④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。1）表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2）与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。3）若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。4）HgCl2效果最好，但对实验材料的危害最大，要用水冲洗至少5次。消毒注意事项第三章外植体的选择和灭菌第一节外植体的选择第二节外植体的灭菌方法第三节污染原因和预防措施第三节污染原因和预防措施1、污染的原因污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。1.1污染的原因：从病源菌方面：主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径：外植体带菌培养基器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程等引起的。1.2细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。原因：材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程因此接种人员的手应经常用70%酒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。1.3真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。原因：周围环境不清洁超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大等为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。污染后的措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。2污染的防治措施2.1防止材料带菌的措施2.2外植体的灭菌2.3玻璃器皿的灭菌2.4金属器械的灭菌2.5布质制品的灭菌2.6无菌操作室的灭菌2.7操作2.1防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。枝条插入无糖的营养液或自来水，以新抽嫩枝条作为外植体；或暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝接种。（2）选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不要去年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，可以收到一定的防污染效果。2.2外植体的灭菌（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌。除去主脉、叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；消毒处理次日再次消毒对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，（2）多种药液交替浸泡法对容易污染而难灭菌的材料：2.3玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。2.4金属器械的灭菌火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘米2（即15磅/英寸2），121℃的温度，灭菌20min～30min。2.5布质制品的灭菌2.6无菌操作室的灭菌无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。2.7操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行防止操作带来的污染A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速正确错误B、接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染正确错误C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口防止操作带来的污染正确错误小结：常用的灭菌方法物理方法化学方法干热灭菌(烘烧和灼烧)湿热灭菌(常压或高压蒸煮)射线处理(紫外线、超声波、微波)过滤除菌大量无菌水冲洗升汞(氯化汞)甲醛(福尔马林)过氧化氢高锰酸钾来苏儿漂白粉次氯酸钠酒精不耐热的物质的过滤灭(除)菌一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。防细菌滤膜网孔的直径为0.22-0.45μm以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。小结第一节外植体的选择：优良种质、健壮植株、最适的时期、适宜的大小。第二节外植体的灭菌方法：常用灭菌药剂的使用及其效果、外植体的灭菌方法。第三节污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。复习思考题在组培中如何做好外植体的选择工作？用于外植体灭菌的常用药剂有哪些？各其的特点如何？组培中污染的原因是什么？如何预防？