54电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳技术第一节第二节常见电泳技术常见电泳技术电泳技术概述电泳技术概述第二节第二节常见电泳技术常见电泳技术纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳一聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳二SDSSDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚丙烯酰胺凝胶电泳三琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳四等电聚焦电泳等电聚焦电泳六二维聚丙烯酰胺凝胶电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳七印迹电泳印迹电泳八毛细管电泳毛细管电泳九梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳五二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE））聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGEPAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。⑧可用作固定化酶的惰性载体⑧可用作固定化酶的惰性载体⑦无紫外吸收⑦无紫外吸收⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存⑤透明度好，便于照相和复印⑤透明度好，便于照相和复印④电泳分离的重复性好④电泳分离的重复性好③化学惰性好，电泳时不会产生③化学惰性好，电泳时不会产生““电渗电渗””②更②更高的灵敏度：高的灵敏度：1010－－99～～1010－－1212mol/Lmol/L①可用于分离不同分子量的生物大分子①可用于分离不同分子量的生物大分子11、聚丙烯酰胺凝胶的特点、聚丙烯酰胺凝胶的特点聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的特特点点22、凝胶聚合的原理及有关特性、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应　凝胶单体丙烯酰胺Acr加速剂四甲基乙二胺TEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素（（22）凝胶孔径的可调性及其有关性质）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）=其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)　C(交联剂百分比)（%）=100×+mba100×+bab凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性完全透明而又有弹性a/b＜10a/b＜10a/b＞100a/ba/b＞＞100100a/b=30a/b=30a/b=30a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b=20a/b=20左右左右a/b=40a/b=40左右左右a/b=125a/b=125--200200左右左右T为2%-5%TT为为2%2%--5%5%T为5%-10%TT为为5%5%--10%10%T为15%-20%TT为为15%15%--20%20%不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，DavisDavis的的实验发现实验发现AcrAcr＜＜2%2%，，BisBis＜＜0.5%0.5%，凝胶就不能聚合，凝胶就不能聚合。。当增加当增加AcrAcr浓度时要适当降低浓度时要适当降低BisBis的浓度。的浓度。C=6.5C=6.5−−0.3T0.3T②凝胶浓度与孔径的关系②凝胶浓度与孔径的关系TT浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。孔径还同孔径还同AcrAcr与与BisBis的比例有关，的比例有关，BisBis占占AcrAcr总浓度总浓度5%5%时，时，孔径最小孔径最小。。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在33％－％－3030％之间。％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径低浓度的凝胶具有较大的孔径高浓度凝胶具有较小的孔径高浓度凝胶具有较小的孔径10～1540～100KD15～205～1020～302～5分离胶浓度（%）10～40KD10KD蛋白质相对分子量100～500KD500KD③凝胶浓度与被分离物相对分子量的关系③凝胶浓度与被分离物相对分子量的关系分析纯；分析纯；pHpH值为值为4.94.9--5.25.2；；44℃℃避光贮存避光贮存AcrAcr及及BisBis纯度纯度聚合在聚合在4040--60min60min内完成内完成APAP核黄素核黄素TEMEDTEMED碱性条件下聚合较快，但碱性碱性条件下聚合较快，但碱性过强时胶硬而脆过强时胶硬而脆pHpH33、影响凝胶聚合的因素、影响凝胶聚合的因素一般一般2525--3535℃℃聚合聚合温度温度凝胶先抽真空脱气，再加引发剂凝胶先抽真空脱气，再加引发剂氧分子氧分子33、影响凝胶聚合的因素、影响凝胶聚合的因素4、PAGE原理　浓缩效应浓缩效应有无浓缩效应有无浓缩效应连续系统连续系统不连续系统不连续系统分子筛效应分子筛效应电荷效应电荷效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应不连续体系不连续体系电极电极缓冲液缓冲液分离胶分离胶样品胶样品胶浓缩胶浓缩胶样品胶样品胶T=3%,c=2%T=3%,c=2%，其中含有一定量的，其中含有一定量的样品及样品及pH6.7pH6.7的的TrisTris--HClHCl缓冲液，其作用缓冲液，其作用是防止对流，促使样是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。冲溶稀释。直接在样品液中加入直接在样品液中加入等体积等体积40%40%蔗糖。蔗糖。浓缩胶是样品胶的浓缩胶是样品胶的延续，凝胶浓度及延续，凝胶浓度及pHpH值与样品胶完全值与样品胶完全相同，其相同，其作用是使作用是使样品进入分离胶前样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区，被浓缩成窄的区带带，从而提高分离，从而提高分离效果。效果。浓缩胶浓缩胶分离胶的分离胶的T=7.0%T=7.0%--7.5%,c=2.5%7.5%,c=2.5%，缓冲，缓冲液为液为pH8.9pH8.9的的TrisTris--HClHCl，大部分蛋白质，大部分蛋白质在此在此pHpH条件下带负条件下带负电荷。此胶主要起电荷。此胶主要起分分子筛作用子筛作用。。分离胶分离胶③电位梯度的不连续性③电位梯度的不连续性（（11）样品浓缩效应）样品浓缩效应②②凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性①①缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性分离胶分离胶pH8.9pH8.9浓缩胶浓缩胶pH6.7pH6.7①①缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性samplesamplesamplesampleGlyGly--ClCl--GlyGly--ClCl--电极缓冲液电极缓冲液pH8.3pH8.3GlyGly--HClHCl在任何在任何pHpH溶液中均易溶液中均易解离出解离出((ClCl--))，在电场中迁移率，在电场中迁移率快，走在最前面称为快，走在最前面称为快离子快离子。。甘氨酸甘氨酸pIpI=6.0=6.0，在，在pH8.3pH8.3的的电极缓冲液中，易解离出电极缓冲液中，易解离出甘氨甘氨酸根酸根(NH2CH2COO(NH2CH2COO--))，而在，而在pH6.7pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有氨酸解离度仅有0.1%0.1%--1%1%，，，，称为称为慢离子慢离子。。大多数蛋白质大多数蛋白质pIpI在在5.05.0左右左右，在，在pH6.7pH6.7或或8.38.3时均带负电荷时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。，被浓缩成为极窄的区带。分离胶为小孔胶分离胶为小孔胶浓缩胶为大孔胶浓缩胶为大孔胶在电场作用下，样在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。而压缩成很窄的区带。samplesamplesamplesample②②凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性电泳开始后，快离子的快速电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。浓缩成狭窄的区带。ClCl--samplesamplesamplesampleClCl--ClCl--ClCl--低电导区，使局部电低电导区，使局部电位梯度增高位梯度增高③电位梯度的不连续性③电位梯度的不连续性（（22）分子筛效应）分子筛效应大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。　蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。（（33）电荷效应）电荷效应在在pH8.9pH8.9的分离胶中，的分离胶中，各种带净电荷不同的各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。，因而称为区带电泳。pHpH值的不连续性值的不连续性凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性缓冲体系离子成分不连续性缓冲体系离子成分不连续性电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性四个“不连续性”促“浓缩”不连续PAGE原理总结电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应两个“效应”促“分离”不连续PAGE原理总结电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应连续连续PAGEPAGEPAGEPAGE连续体系虽然电泳过程中无浓缩效应，连续体系虽然电泳过程中无浓缩效应，但利用但利用分子筛及电荷效应分子筛及电荷效应也可使样品得到较好的也可使样品得到较好的分离，加之在温和的分离，加之在温和的pHpH条件下，条件下，不致使蛋白质、不致使蛋白质、酶、核酸等活性物质变性失活酶、核酸等活性物质变性失活，也显示了它的优，也显示了它的优越性。越性。三、三、SDSSDS－－PAGEPAGE11、原理、原理SDS-PAGE的基本原理与PAGE的原理相同，不同之处在于：在SDS-PAGE中，样品介质和聚丙烯酰胺中添加了离子去污剂（如SDS，十二烷基磺酸钠）和强还原剂（如巯基乙醇）。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基的分子大小，而电荷电荷因素可以忽略。SDSSDS即十二烷基磺酸钠，是阴离子去污剂，在水溶即十二烷基磺酸钠，是阴离子去污剂，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与的浓度与SDSSDS总浓度、离子强度及温度有关。总浓度、离子强度及温度有关。（1）SDS断裂分子内或分子间氢键分子内去折叠破坏蛋白质分子的二、三级结构阴离子去污剂助溶剂变性剂在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS单体能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4gSDS/g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g蛋白质。（（22）巯基乙醇：使蛋白质）巯基乙醇：使蛋白质分子中的二硫键还原，使分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。多肽分成单个亚单位。S