肉毒毒素基本知识

肉毒毒素介绍主要内容肉毒毒素介绍•历史发展•结构•作用机理•药理毒理免疫原性目前商用的肉毒素及保妥适的特点保妥适配制注意事项什么是肉毒毒素?(肉毒神经毒素,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素)是肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素•一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科•在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生长为梭菌•细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来•不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒素(分为A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型),其中A型毒力最强•是导致肉毒中毒(Botulism)的原因生物制品的特定没有仿制品的概念•肉毒毒素是一类产品名，而非通用名•与疫苗接近产品本身没有专利，生产工艺专利用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算很容易得到，很难提纯，很难恒定FDA最新通告：历史和发展（1）1920s19441946•首次沉淀纯化A型肉毒毒素（H.Sommer)•Schantz开始研究其特性和应用•Lammanna首次分离出A型肉毒素结晶18201895JustinusKerner推测“腊肠毒”作用原理，并提出应用于治疗的可能性•EVanErmengem分离肉毒梭状芽胞杆菌历史和发展（2）1960’s–1970’s19781984Schantz和Scott继续研究Scott在猴子身上进行A型肉毒毒素治疗斜视的试验Scott获得FDA批准在人身上进行试验（眼睑痉挛，半面肌痉挛）1950’s1950’s–1960’sVBrook证实A型肉毒毒素阻断乙酰胆碱释放纯化过程优化(DuffandSchantz)MFBrint用于治疗眼睑痉挛，半面肌痉挛斜颈，喉部肌张力障碍，书写痉挛等…历史和发展（3）199820062009FDA批准低蛋白剂型每100单位5ng19891997Allergan获得FDA批准以BOTOX商品名上市；用于治疗眼睑痉挛，斜视和第VII神经功能紊乱Allergan公司获得对A型肉毒素的所用权1998年6月中国药品监督管理局批准保妥适®用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关病灶肌张力障碍。2006年6月GSK在中国上市保妥适®2002FDA批准美容适应症83个国家22个适应症2月11日获中国SFDA批准用于皱眉纹不是个合适的生化武器温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解雾状的毒素，很不稳定常规的消毒方法既能使其灭活•氯，加热85C5分钟人与人不能传播存在肉毒素抗毒素（但对已经存在的症状无效）高纯度的保妥适®治疗不会导致肉毒中毒肉毒中毒:•肉毒毒素导致的一种全身性的反应保妥适是高度纯化的肉毒素•局部注射治疗,直接注射在相关肌肉或腺体上•如剂量合适,很少弥散到其它肌肉•治疗剂量与中毒剂量相差很远•皱眉纹标准剂量：20U致死剂量(70kg人)静脉注射3,000单位要导致死亡,需静脉注射30瓶以上保妥适®每瓶保妥适®只含100单位纯化的肉毒素每瓶保妥适含蛋白5ng1ng=10-9g保妥适®是局部用药BOTOX®弥散效应剂量Aoki,Neurology2003;60(5Suppl1):A212-A213ABS-P03.088本研究的临床相关性有待明确靶肌肉邻近肌肉全身作用在治疗剂量内，血液中检测不到肉毒素前体毒素－900KD复合体HA(Haemagglutinin),血凝素NTNHnon-toxicnon-haemagglutinins非血凝素蛋白COOHNH2NH2COOHS-SSSHeavyChain重链LC轻链肉毒素结构150KD100KD50KD与靶位受体结合，促轻链内转以锌肽链内切酶实施毒效血凝素维持毒素三维结构稳定影响结构因素：热变性，碱性条件空气/液体介面形成的气泡改变毒素形态，氮气/二氧化碳稀释至过低浓度作用机理(1)正常神经递质释放过程神经肌肉接头神经末梢肌肉细胞肌肉细胞肌肉纤维收缩突触间隙乙酰胆碱乙酰胆碱受体神经终点SNARE蛋白突触囊泡蛋白突触融合蛋白突触相关蛋白突触囊泡SNARE蛋白形成复合体突触融合复合体囊泡和终板膜融合神经递质释放作用机理(2)当有神经肉毒素时肌肉细胞肌肉纤维瘫痪肉毒素轻链水解特异SNARE蛋白轻链SNARE复合体不能形成膜没有融合神经递质不能释放肉毒素以胞饮方式进入重链B,D,F,G型A,C,E型C型尚有其它作用机理–如疼痛作用机理录像作用过程主要步骤：结合（Binding）：•A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合摄入（Internalization)：•毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端细胞膜将毒素包裹，在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。阻断（Blocking)•A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维传导。神经芽生(Sprouting)•充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域，也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质神经再生•“芽生”是暂时的，会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。乙酰胆碱的作用颅神经骶神经胸腰神经节前神经节节后CNS副交感神经交感神经交感神经交感神经躯体运动神经AchAchAchAchAchAchAchNM交感神经NENNNNAchMDNEpiAch胆碱能性神经：运动神经全部植物神经节前纤维大多数副交感神经节后纤维支配小汗腺和血管肌肉的交感神经节后纤维SNAP-25Ca++ChannelsSyntaxinVAMP/synaptobrevin还阻滞其它物质的释放对疼痛的作用GlutameatcGRPSubstanceP躯体运动神经元Α-梭外肌-收缩减少γ–梭内肌-传入信号减弱内脏运动神经元-内脏平滑肌收缩减少腺体分泌减少痛觉感受器肉毒毒素阻滞位点作用机理的临床意义BOTOX®临床应用范围日益扩大失驰缓症多汗症*偏头痛斜视*痉挛性斜颈*脑瘫眼睑痉挛*神经肌肉自主神经感觉神经膀胱美容*保妥适全球被批准情况适应症被批准国家数适应症被批准国家数眼睑痉挛79肛裂5斜颈65肌震挛5半面肌痉挛62原发震颤5儿童脑瘫61头痛4成人痉挛54胃失迟缓症4多汗54颈痛1皱眉纹和其它面纹52膀胱过动3斜视37磨牙症3第7神经功能紊乱23肌筋膜痛1构音障碍8鼻唇线1背痛5多发性硬化183个国家，22个适应症保妥适®在中国的适应症1998：•眼睑痉挛、面肌痉挛及相关局灶性肌张力障碍。2009年2月：•暂时改善65岁及65岁以下成人因皱眉肌/或降眉间肌活动引起的中度至重度皱眉纹。基本药理单位的定义有效性安全性抗原性单位的定义生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量肉毒素单位定义:•1Unit(单位)=i.p.LD50•小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50)•不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换•有各自的实验和检测方法说明书：本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。文献上关于保妥适®的推荐剂量只适用于保妥适®，对其他A型肉毒毒素不一定适用。有效性的判断局部有效性：•用DAS评估•DigitAbductionScore小鼠后趾外展评分方法•测试去神经化程度•局部肌肉注射的ED50•半数有效量•DAS=2时剂量DAS评分方法注射前注射后4分严重弱化0分没变化1分2分3分用DAS测试小鼠肌肉弱化程度012340481216200.5%BSA/Saline.5u/kg(BoTx-A)1u/kg5u/kg10u/kg30u/kgDigitAbductionScoreMean±SEM(n=10)注射后天数严重正常DAS量效关系（对数值）平均DAS峰值毒素剂量,U/kg此图可用来比较不同产品的效力J.FrancisPoster#51,Toxins2005ToxinsED50±SEM(U/kg)保妥适X®(n=6)3.4±0.3兰州BTX-A(n=6)5.7±0.3Dysport®(n=3)16.2±1.1Myobloc™(n=5)23.4±1.4平均DAS(小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线保妥适®效力最高的肉毒素*p0.05one-wayANOVAandposthocTukeyt-test*注意：非线性关系局部和全身效应：弥散系数ToxinDose,U/kg110100Response01234全身效应弥散平均DAS峰值毒素剂量,U/kg达到最大局部效果弥散系数(DiffusionMargin)=AtrthreshED50Atrthresh:注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量•作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用•在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的•临近肌肉•全身K.RogerAoki,PhD,PharmacologyofBotulinumToxins不同产品的弥散性不一样保妥适®弥散其它肉毒毒素®弥散效应剂量在达到最大局部效应前就从注射部位弥散出去了Aoki,Neurology2003;60(5Suppl1):A212-A213ABS-P03.088本研究的临床相关性有待明确抗原性抗原:•能触发抗体产生的外来分子，抗原表面有非常特异性的抗体结合部位，这称为抗原决定簇。抗体:•抗体（也称为免疫球蛋白[Ig]）是针对抗原而产生的。只有相对应的抗原决定簇出现时，抗体才被激活。免疫应答反应具有记忆和强化功能中和抗体使毒素失去作用中和抗体中和抗体非中和抗体非中和抗体抗原测试方法（I）WBA（WesternBlotAnalysis蛋白印迹分析）•不能区分中和抗体和非中和抗体ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验)•分析血标本中有无保妥适®抗体及其含量的敏感的体外方法。•ELISA不能区分保妥适®的中和抗体与非中和抗体抗原测试方法（II）MPA(Mouse-ProtectionAssay小鼠保护试验)•是目前测试抗体的金标准•唯一能准确测试中和抗体的方法•价格昂贵、费时,只有阴性和阳性之分FTAT(FrontalisAntibodyTest前额抗体试验)•简便,很快有结果•与其它方法相关性好=7.5U=15U效果不佳不都是因为抗体注射技术不正确•如剂量过低或注射在错误的肌肉上对所注射的肌肉功能了解不全没有注射所有引起症状的肌肉要达到功能效果还需控制拮抗肌肌肉挛缩已到固定程度减少抗体产生的危险每次使用最低剂量•也就是降低接触神经毒素蛋白(ng)的可能延长使用间隙•由产品的作用时间决定使用高纯度，性质稳定/均一的产品•新配方大大降低抗体的产生率*Jankovicetal.(2003)Yablonetal.(2005):保妥适的特点目前商用肉毒素保妥适Botox衡力DysportXeominNeurobloc/Myobloc厂家Allergan兰州生物IspenMerzSolstice菌株HallAHallANCTC2916HallABean毒素类型A型A型A型A型B型每瓶单位100U或50U100U或50U500U100U5000，10000,20000稳定剂0.5mgHAS20mg明胶（动物来源）0.125mgHAS1mgHAS0.05%HAS其它辅药0.9mgNaCl葡聚糖25mg蔗糖25mg2.5mg乳糖25mg乳糖0.01M琥珀酸钠，0.1MNaCl,最终的剂型真空干燥低压冻干（冻干）低压冻干（冻干）低压冻干（冻干）溶液纯度高,质量恒定肉毒毒素是一种生物产品，其生产工艺远比化学药品复杂。很难做到批与批，瓶与瓶之间的质量恒定。生产过程中不慎被灭活的肉毒毒素无治疗作用，但具有免疫原性，可激发肌体产生抗体，令使用者产生继发性无应答。使用保妥适®，医生可精确知