2010版--原料药GMP实施指南发酵部分

18.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求原料药GMP实施指南34618.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求本章将探讨以下问题：采用发酵工艺生产原料药对细胞库有哪些特别的要求？采用发酵工艺生产原料药对菌种培养与发酵有哪些特别的要求？采用发酵工艺生产原料药对收集、分离与纯化有哪些特别的要求？采用发酵工艺生产原料药对病毒去除和灭活有哪些特别的要求？本指南适用利用自然界存在的微生物或用传统方法（如辐照或化学诱变）或使用基因改造技术的微生物发酵生产的原料药，通常是指小分子的产品如抗生素，氨基酸、维生素和糖类；而“生物技术”即指用重组DNA、杂交瘤或其它技术产生或修饰的细胞或组织来生产蛋白质和多肽这类大分子量的物质，虽然发酵原理与传统发酵时一样的，但是它们的控制程度不同，总的来说，用于生产大分子的生物技术工艺的控制要严于经典的发酵工艺，所以生产大分子的生物技术工艺不在本指南范围，本指南仅涵盖了从细胞库取得用于生产的细胞开始的细胞培养/发酵、收集分离纯化得到昀小分子终产品的全过程。传统发酵产品的一般生产流程为：保存管种子培养（孢子或菌丝形式）种子罐种子培养主发酵罐发酵固液分离目的产物提取纯化由于其所用的原料（培养基、缓冲液组分）可能为微生物污染创造条件，应在生产过程中根据物料来源、制备方法和原料药或中间体的预期用途，可能有必要在制造和工艺监测的适当阶段控制微生物、病毒污染和/或内毒素，特别注意防止微生物污染。在工艺控制可重点考虑以下内容：主菌株库和工作菌种的建立和维护；接种和扩增培养；发酵过程中关键操作参数的控制；包括质量、杂质指纹的控制菌体生长、生产能力的监控；收集和纯化工艺过程——此工艺去除菌体、菌体碎片、培养基组份，需保护中间产品和原料药不受污染（特别是微生物学特征），避免质量下降；在适当的生产阶段进行生物负荷监控，必要时进行细菌内毒素监控。必要时，可以考虑验证培养基、宿主微生物蛋白、其它与工艺及产品有关的杂质和污染物的去除效果18.1细胞库的维护和记录的保存【法规要求】《药品生产质量管理规范》2010修订版：原料药GMP实施指南18.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求347第五十条菌种的维护和记录的保存1.只有经授权的人员方能进入菌种存放的场所；2.菌种的储存条件应能保持菌种活力并防止污染；3.菌种的使用和储存条件应有记录；4.应对菌种定期监控，以确定其适用性；5.必要时应进行菌种鉴别。【背景介绍】对于传统发酵工艺生产的原料药，其关键是作为发酵的源头和命脉---微生物菌种的控制，这里包含两个层面的控制，一是保证菌种的不变异和不衰退，二是保证菌种的不污染，从而维护保障企业本身的利益和产品的产率以及质量的稳定性。菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的变异和衰退。变异有正变异和负变异，负变异被称为衰退。常见的衰退现象：菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；抵抗力、抗不良环境能力减弱等；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降。在菌种生产过程中，应建立有效的方法，包括控制传代次数、选择合适的培养条件和采用有效的保藏条件，从而保证发酵产物和组分的批间一致性。中国药典对于生产生物技术产品及生物制品的利用重组DNA、杂交瘤或其它技术产生或修饰的人和动物细胞系和微生物细胞系以及为用于生产的细胞库的制备和鉴定建立标准提供明确的指导，但是对于传统发酵工艺的菌种以及用于生产的细胞库的制备和维护没有明确的指导。新版GMP参照ICHQ7第十八章中给出了对于细胞繁殖/发酵生产的细胞库非常有效的管理系统，以确保生产水平的稳定和均一性。【技术要求】本标准所涉及的细胞库是指用于临床试验操作、商业化生产的微生物菌种，包括研究或开发的原始细胞库（PreliminaryCellBank,PCB）、于GMP条件下制备用于生产的主细胞库（MasterCellBank，MCB）和工作细胞库（WorkingCellBank，WCB）。为了预防在重复的传代培养过程中出现的表型或基因型的改变，微生物菌种应确定合适的保存条件、保藏期限和允许传代次数后建立主细胞库及工作细胞库。开发发酵工艺新的原料药的微生物菌种要具有记录其历史的文件和记录，并能支持上市许可。用于GMP生产的微生物菌种可通过制备的主细胞库和工作细胞库追溯其来源。若每年生产的产品仅需有限的几支细胞时，仅建有MCB而没有WCB的单级细胞库，原则上亦是允许的。主细胞库和工作细胞库（或种子批）的制备应在有洁净区进行，敞口操作应在A（100级）的生物安全柜中进行，每支保存管均应贴标签，注明名称编码、批号、冻存管编号等。在所有ISO分类区域应进行尘降菌及悬浮粒子的环境18.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求原料药GMP实施指南348监控，包括生物安全柜。应对生产菌种的保存条件进行研究，并确定合适的保存条件能够在一定的保藏期限内保持菌种的活力，保证菌种的不变异和退化，同时该条件能够防止污染而保证生产菌种的纯种培养。细胞库房应要恒温、恒湿；避光、暗凉、通风通气。室内应有防螨、防霉措施和定期消毒，防止污染，保存条件应有记录，并可以实施预警系统来保证菌种的有效保存。细胞库房只有经授权的人员方能进入，可以实行双人双锁管理，菌种入库和出库应专帐、专册。应对菌种定期监控，如无菌、纯度、存活率、生长特性、生产能力和发酵组分等的考察，以确定其适用性；必要时应进行菌种鉴别，包括表型和基因型的分析鉴别以及遗传稳定性的考察。【实施指导】实验室接收到微生物菌种时，应及时登记相关资料，在其来源、培养历史、检测结果及运输条件未确认前要与其他表征的细胞进行有效的物理隔离，直到其来源、培养历史、检测结果及运输条件被接收并证实。不同的微生物菌种在培养操作过程中应物理隔离或分时段操作；严格执行清洗和消毒程序，使潜在污染危害昀小化；选择实验室的材料和试剂的使用处理方式，以确保交叉污染昀小化。对于微生物菌种，在放行到GMP厂房之前，文件、培养历史的复核、检测结果应建立并证实。检测确定培养物无染菌，并且具备所要求的表型特征。用于GMP生产的细胞系和微生物菌种的历史通常情况下包括：微生物菌种的亲本特征，包括基因和种属的来源、鉴别；尤其是通过转基因技术得到的微生物菌种(GMO)，必要时应对基因毒性和其代谢产物指纹图谱特征进行对比分析；微生物培养操作与培养基配方的实验室记录；所有检测的清单；从亲本细胞系和微生物菌种扩增的物理控制（如保存地点）的历史；任何用于维持、扩增细胞系或微生物菌种的动物来源物料信息。用于制备主细胞库和工作细胞库的原材料原则上应不得含有动物来源的原材料，原材料供应商应提供文件证明其产品不含动物源成分。生产用微生物菌种的检定包括但不限于：污染菌检查（微生物、真菌、支原体的检测分析）表型特征确证生产能力确定传代稳定性组份检测孢子量检测原料药GMP实施指南18.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求349杂质指纹鉴定大肠杆菌菌种的噬菌体检查原则上，主细胞库（或主种子批）和工作细胞库（或工作种子批）应分别存放；非生产用细胞应与生产用细胞应分开存放；已检测和未检测的细胞应分开存放。微生物菌种经检定合格后，应根据其微生物的特性选用适当方法及时保存。所有的细胞库应保存在安全区域中，有库存记录，保存容器应该具有温度监控，并可以通过可持续报警装置保证温度的可控性。细胞库只有经过授权的人员方可以进入，如：通过实施双人双锁制度，来避免菌种的混淆和错取。从低温保存中取出的主细胞库和工作细胞库不得放回用于生产。工作细胞库应定期（如每一年）进行一次遗传稳定性监测，如有问题应立即停止使用并重新制备工作细胞库。当使用的WCB工作库不足量时，应重新建立新一批的工作细胞库。应对WCB批次的变更进行控制。必要时应该进行菌种鉴定。为了防止产品供应可能出现的突发事件，应制备充足数量的主细胞库和工作细胞库，可存放在2个或2个以上地点以作异地备份。备份运输过程中，主细胞库和工作细胞库应置于合适的条件下中运输，同时可使用数据采集装置以记录运输过程中的温度变化。当菌种的质量考查达不到规定的指标，或原生产菌种被新菌种替代，或菌种受污染时，该菌种应采用适当的方式，在相关监管部门的监督下实施销毁，并做好销毁记录。应当对菌种接触过的所有用具清洗，并采用适当的方式进行灭活，并做好记录。【实例分析】A.主菌种（MCB）和工作菌种（WCB）目前对于微生物发酵产品的质量控制，对于主菌种（MCB）和工作菌种（WCB）越来越重视，但是很多企业只是纯粹把保存的菌种按照保存代次的不同而简单地认为MCB和WCB，或者把保存在一个更低温的条件（如-80℃）的细胞库当为MCB，而故意把WCB保存在一个相对高温（如-20℃或4℃）的条件缩短其保持期限，以示区别。而实际上对于MCB和WCB的定义，不是制备方法和保存条件的差异，而是不同的质量检测控制指标的差异，每一个发酵产品的菌种需要不同的质量标准去衡量MCB和WCB,检测合格后方可启动，通常情况下MCB的检测指标项多于WCB。B.何时制备新工作库？制备新工作库后，需要检测哪些指标方可使用？通常在以下情况需要制备新工作库：工作库发现有问题或因为保存条件的改变，应立即停止使用，重新制备工作细胞库。当使用的工作库不足量时，应重新制备工作细胞库。当使用的工作库保存时间即将超过保存期限时，应重新制备工作细胞库。18.采用发酵工艺生产原料药的特殊要求原料药GMP实施指南350制备新工作库时，除常规的指标检测，如污染菌检查（微生物、真菌、支原体的检测分析）、生产能力确定、组份检测、孢子量检测等，还需要和主菌种进行遗传稳定性比较，通常采用保守区域的基因序列比较或基因组的限制性酶切图谱方法确认。C.微生物发酵产品通常会采用化学、物理诱变方法或者基因技术对微生物菌种进行选育或基因改造，得到一个更高产能效率的新菌种，那么是否可以使用该诱变后的新菌种应用于商业化生产？提高质量和产能效率是微生物发酵产品的永远追求目标。过去往往一旦获得一个高产的新菌株，就没有进行任何验证的情况下用于商业化生产；而现在随着GMP的推行和严格，很多企业因为担心而不敢使用新的高产菌株。其实，得到一个新的高产菌株，经过一定的检测和验证，包括污染菌检查（微生物、真菌、支原体的检测分析）、表型特征确证、生产能力确定、传代稳定性、组份检测、孢子量检测等检测指标，尤其是杂质指纹比较后，确定没有问题后可以建立新的主细胞库和工作细胞库，用于商业化生产。但是更换主细胞库，应提供相关的文件，需要事前告知客户，并按照变更注册。但是有一种情况需要特别注意的，即采用基因改造技术提高产量或降低杂质得到的GMO新菌株的使用，虽然从理论上认为中断或增加某功能基因或调节基因，并不影响其他的代谢途径，但是微生物代谢往往是一个代谢网络，人为基因的修饰会导致微生物代谢紊乱，不确定产生其他的杂质，这样潜在的非预期风险很大。如在1989年一家日本公司生产色氨酸,为提高色氨酸的产量,插入4个基因,从而增加了很多不同的杂质,其中产生的一种1,1‘-ethylidenebis[L-tryptophan]是嗜酸性红细胞过多肌痛综合症（EMS）的原因,从而导致37人死亡、1500人得了伴随严重痛苦的慢性疾病，成为历史上有名的色氨酸灾难事件。所以使用基因技术得到的微生物菌株用于生产需要非常谨慎，需要一定的检测和验证，尤其是杂质指纹比较验证并确定无毒风险，方可以使用。【要点备忘】菌种的历史背景，包括来源等；主菌种和工作细胞库的制备记录和检测报告；细胞库变更控制；菌种传代代次是否控制；细胞库的保存是否有制度并有相应的温度和湿度记录，是否有预警系统；制备细胞库是否用到动物来源物料，尤其是对BSE\TSE和三聚氰胺等风险；微生物菌种是否为GMO菌种，若是则如何控代谢产物的同一性；是否存在基因毒性问题；细胞库是否有异地保存作为备份；菌种是否有转移过程，如何控制转移条件。18.2菌种培养和发酵【法规要