微生物菌种鉴定与保藏

1微生物菌种鉴定与保藏柳志强浙江工业大学生物工程研究所2008·[e-mail]134861184632内容1.菌种筛选2.菌种鉴定3.菌种保藏3微生物代谢产物的平板检测方法有机酸:柠檬酸:pH指示剂的颜色变化,或掺入琼脂平板的碳酸钙的溶解.胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄榄油琼脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果胶酶:果胶凝胶的液化(1.5%的聚果胶酸钠),多糖沉淀剂5.弹性蛋白酶:弹性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸过量时可见混浊.或者氮蒽橙荧光和紫外荧光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混浊圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纤维素酶:纤维素平板的透明圈10.酯酶:氯化钙和Tween20释放出的月桂酸反应生成月桂酸钙沉淀.或者7-羟-4甲基香豆素荧光反应.DNA酶:亚甲胺蓝的DNA荧光变化过氧化酶:喷洒对-茴香碱-过氧化氢酶抑制剂:(用含酶的琼脂平板上的抑制圈筛选)1.胰蛋白酶抑制剂:2.蛋白酶抑制剂其他的代谢物:1.脂类.酵母的脂类营养缺陷型的生长谱来捡出2.NAD:以猪流感嗜血菌（haemophilusinflluenzae）的生长谱来捡出3.雌激素:喷洒对硝基苯重氮盐（1%在50%乙酸中）形成红色捡出4.chlorostatin:Euglenagracilis褪绿圈4567影印法8显微镜第一代第二代第三代9细菌的形态和结构观察在显微镜下观察细菌个体的形态细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。10细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。11细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。12放线菌菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状或分枝状。菌丝呈各种颜色，有的能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子形状各异。由于孢子的存在使菌落表面呈干粉状。链霉菌13霉菌是由交织在一起的菌丝体构成。菌丝呈管状，有的有横隔将菌丝分割为多细胞（如青霉、曲霉），有的菌丝没有横隔（如毛霉、根霉）。菌丝直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到几十倍。菌落形态较大，质地疏松，颜色各异，有丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体。将菌丝体放在水中易变形，将其置于乳酸石炭酸溶液中，保持菌丝体原形。14几类酵母的菌落形态1.酿酒酵母2.产肮假丝酵母3.出芽短梗霉4.多孢丝抱酵母5.荚复膜孢酵母6.解脂复膜孢酵母7.季也蒙有孢汉逊酵母8.碎囊汉逊酵母9.卡氏酵母10.鲁氏酵母11.深红酵母12.玫红法佛酵母13.大型罗伦隐球酵母14.美极梅奇酵母15.浅红酵母1516一些鉴别培养基17来源于不同微生物的抗生素放线菌产生链霉素、红霉素、四环素、利福霉素庆大霉素、麦迪霉素、林可霉素等真菌产生青霉素、头孢菌素C等细菌产生多粘菌素、杆菌肽等目前已筛选出抗生素达9000种以上，每年还新增百余种。投入生产的仅百余种。菌种—发酵工业的核心18CurrentMethodsofIdentification19BIOLOG自动微生物鉴定系统20检测原理BIOLOG以检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的酶与四唑类物质（如TTC、TV）发生颜色反应和浊度差异为基础，运用独有的显型排列技术检测出每种微生物的特征指纹图谱，在大量试验和数学模型基础上，建立起指纹图谱与微生物种类相对应的数据库。检测时通过智能软件将待鉴定微生物的图谱与数据库参比，即可得出鉴定结果。21鉴定步骤分离纯化平板扩大培养制备菌悬液调整浊度接种培养获取结果22TheBacterialIdentificationProcessStep1Step2Step3Step4Step5IsolateapurecultureonBiologmediaDoaGramstainanddeterminetestingprotocolPrepareinoculumatspecifiedcelldensityInoculateandincubateMicroPlateReadMicroPlateanddetermineID23TheFungiIdentificationProcessStep1Step2Step3Step4Step5IsolateapurecultureonBiologmediaHarvestsporesfromtheFungiPrepareinoculumatspecifiedcelldensityInoculateandincubateMicroPlateReadMicroPlateevery24hoursanddetermineIdentification24PureCulturesareImportantKrieg,Bergey’sManual,198625挑取菌落用木制接种棒挑取分离良好的单菌落26BIOLOG常用消耗品Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培养基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鉴定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接种液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,FF-IF其它通用消耗品疏基乙酸钠，水杨酸钠，试管架，吸嘴，加样槽，一次性移液管，长棉签，木制接种棒。27微生物鉴定（95种碳源）微生物研究GN2鉴定革兰氏阴性好氧菌GP2鉴定革兰氏阳性好氧菌AN鉴定厌氧菌YT鉴定酵母菌FF鉴定丝状真菌SF－N2用于革兰氏阴性放线菌和真菌代谢研究SF－P2用于革兰氏阳性放线菌和真菌代谢研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代谢研究（不含碳源）ES用于埃希氏大肠杆菌沙门氏菌的研究（95种碳源）鉴定板种类28PropertiesCharacteristicsZJB-063B.subtilisGramstainingCellshapeSporesSporeshapeSporepositionSwellingofsporangiumCatalaseOxidaseLiquefactionofgelatinStarchhydrolysisNitratereductionVPtest(VogesProskauer)IndoleproductionUreaseMRtest(Methylred)HydrolysisoftyrosineHydrolysisofhippurateFormationofH2SLitmusmilkHydrolysisofcaseinUltilizationofpropionateUltilizationofcitrate+Rod+EllipsoidCentral-+-++++-++----+-++Rod+EllipsoidCentral-++++++-++---++-+Acidproductionfrom:D-GlucoseSucroseGlycerolD-xyloseMaltoseLactoseFructoseD-mannitol++++++++++++++++1CharacteristicsProperties-Milksolidificationpeptonization-Liquefactionofgelatin-Degradationofstarch-Ammoniaproduction-FormationofH2S-Indoleproduction:-Formationofmelanin-Growthoncellulose-Nitratereduction+Urease+Catalase+Cytochromeoxidase-L-rhanose+L-arabinose+Mannose+D-Mannitol+Lactose+D-galactose+Solublestarch+Sucrose+raffinose+Maltose+D-Xylose+D-sorbitol+Nositol+n-butanol+m-cresol-p-cresol-Phenol-Isopropanol+Glycerol+D-Glucose+D-Fructose+CarbonsourceutilizingControl-129Productyield(%)Substrate(nitrile-amide)Reactiontime(min)AmideAcidNitrile120-57.9±2.0123.2±1.41Phenylacetonitrile180-92.3±5.08-120-39.2±1.2558.8±3.52p-Methoxyphenylacetonitrile240-91.3±4.684.9±0.12120-49.6±2.5342.3±3.02p-Methylphenylacetonitrile180-83.1±3.9412.5±0.85120-36.9±0.9859.7±2.11p-Hydroxyphenylacetonitrile240-98.2±4.77-p-Nitrophenylacetonitrile120-95.6±5.24-p-Chlorophenylacetonitrile120-80.4±3.9310.3±0.73Acetonitrile240-9.6±0.5580.2±3.28Acrylonitrile240-4.1±0.7693.9±3.462,2–Dimethylcyclopropanecarbonitrile2404.0±0.099.1±0.3491.2±4.39Benzonitrile240--48.3±2.47Pyazinitrile2402.2±0.05-95.7±6.01β-Aminopropionitrile240--98.8±5.87p-Hydroxyphenylacetamide24094.7±4.693.2±0.17-Acrylamide24093.3±2.993.8±0.14-Pyrazinamide24092.9±4.884.5±0.34-130ElectronmicrographofstrainZJB-05174cells31分子遗传学鉴定32GenomicDNAextraction33Primersdesign16S/18SrDNAsequenceamplification1210020001000750250500(bp)1210020001000750250500(bp)34DenaturingGradientGelElectrophoresis(DGGE)35DNAsequencingmachinesusefluorescentdideoxynucleotides3637383940411001009093505924440.01BacillusaquimarisAY505499BacillusmethanolicusAB112729BacillusfirmusEF032672BacillusoleroniusAY988598BacillussubtilisZJB-063DQ474759BacillussubtilisAB232386BacillusatrophaeusisolateSCH0408AY881241BacilluscarboniphilusAB021182BacilluspseudomycoidesAF013121BacillusindicusAJ583158SporolactobacillusinulinusSPO16SRR234210a