10章-组学研究技术

基因组学研究技术物理图谱基因转录图谱基因组功能分析技术生物信息学技术主要内容物理图谱（physicalmap）测定DNA分子，绘制构成基因组的全部基因的排列和间距。即直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置。目的把基因的遗传信息在染色体上的相对位置线性而系统地排列出来染色体上每个DNA片段的顺序以已知核苷酸序列的DNA片段（STS）为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb）作为基本测量单位（图距）的基因组图。物理图谱物理图的距离依作图方法而异★辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR)★限制性片段作图与克隆作图图距单位为碱基对(bp)。【cR(厘镭):在确定的辐射剂量下染色体断裂的百分率。】物理图谱要素序列位置长的序列中▲物理图：标明各个序列的路标▲通过分子杂交的办法利用DNA双链互补特点一个DNA片段杂交在这个位置说明这个位置的结构与它相似~即这个位置的标记以序列作为标记的位置物理作图的方法★限制酶作图(RestrictionMapping)★基于克隆的基因组作图(clone-basedmapping)★荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)★序标位作图(STS，Sequencetagedsite)物理图谱的意义获得分布于整个基因组的30000个序列标签位点（sequencetaggedsite,STS），使基因组每隔100kb距离就有一个标记在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段DNA克隆如：●酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）●细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）●人工附加染色体（humanartificialepisomalchromosome,HAEC）●人工噬菌体染色体（P1bacteriophageartificialchromosome,PAC）等连续克隆(Contig)限制酶作图DNA链的限制性酶切片段的排列顺序即酶切片段在DNA链上的定位限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列为基础的，核苷酸序列不同的DNA，经酶切后就会产生不同长度的DNA片段，构成独特的酶切图谱(RestrictionMapping)。又称DNA物理图谱DNA分子结构的特征之一DNA是很大的分子，限制酶产生用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分，这些片段在DNA链中所处的位置关系~即DNA物理图谱解决的问题DNA物理图谱是顺序测定的基础指导DNA测序的蓝图Why???限制性作图▼将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置只能应用于较小的DNA分子▼上限取决于作图分子中限制酶位点的频率▼采用6碱基对识别顺序的限制酶适合﹤50KbDNA分子的精确作图限制酶作图基本原理把庞大的DNA先“敲碎”，再拼接以Mb、kb、bp作为图距以STS（sequencetagssite）探针序列为路标主要是把含有STS对应序列的DNA的克隆片段连接成相互重叠的“片段重叠群（contig）1.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH（1）完全降解选择合适的限制性内切酶完全降解待测DNA链(同位素标记)凝胶电泳分离→→自显影→→获得图谱即组成该DNA链的酶切片段数目和大小基本步骤同位素标记32P限制性内切酶电泳末端标记待测DNA的一条链(同位素)酶部分降解控制反应条件使DNA链上酶切口随机断裂避免所有切口断裂的完全降解电泳分离→→自显影比较自显影图谱根据片段大小及彼此间的差异排出酶切片段在DNA链上的位置（2）部分降解12比较排出酶切片段跨叠克隆群(Contig)酶切位点酶切位点完整的物理图谱应包括基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图大片段限制性内切酶切点图DNA片段或一特异DNA序列（STS）的路标图基因组中广泛存在的特征型序列等的标记图（如CpG序列、Alu序列，isochore）【具有mosaic结构,称为isochore。即基因组是由一些较长的大片段（平均长度300Kb）组成,GC含量相对均匀,而在这些大片段的两端GC含量是跃变的,而不是渐变的】跨叠克隆群(Contig)酶切位点酶切位点荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）用DNA纤维分析水稻第4号染色体基于克隆的基因组作图大片段DNA的克隆载体◆YAC:酵母人工染色体230-1700Kb◆BAC:细菌人工染色体300Kb◆PAC:P1人工染色体300Kb◆Cosmids:30Kb重叠群(Contig)：相互重叠的DNA片段组成的物理图Contig组建方法:染色体步移指纹作图克隆作图构建全基因组DNA基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA流式细胞仪分离染色体打断打断染色体步移原理chromosomewalking酶切，插入A基因探针筛选亚克隆片段重新筛选亚克隆片段重新筛选λ亚克隆1相邻λ亚克隆2指纹：确定DNA样品所具有的DNA片段一个克隆的指纹即表示该克隆所具有的限定的顺序特征克隆指纹分析原理如果2个克隆彼此重叠它们一定含有相同的序列克隆指纹主要用于重叠群(Contig)的构建指纹分析方法限制性带型(restrictionpatterns)指纹重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)STS目录作图(STScontentmapping)重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR指纹(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)限制性片段指纹重叠顺序DNA指纹STS指纹Contig序标位(STS)作图长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)可以作STSSTS：sequencetagsitSTS作图原理成套片段2个标签同时出现在6个大片段中只有2个大片段有2个标签染色体DNASTS作图原理寻找STS的方法表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)从cDNA中找到的小段顺序基因家族成员间共有的序列不能用于STSSSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns）随机基因组顺序表达顺序标签EST随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序所获得的部分cDNA序列即EST●EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段●每个EST长度约200～600bp代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列大多数EST的长度不足400bpWhy？？？一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆那么，EST既可能对应于一个cDNA的某一部分又可能代表mRNA的不同剪接方式基因转录图谱（transcriptionmap）转录图谱(基因图谱)在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。即利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱。（genemap）Ortranscriptionmap:在人类基因组中鉴别出占2%至5%的全部基因的位置结构与功能。基本原理：蛋白质推测mRNA的序列，mRNA反转录为cDNA，然后利用其与所测序列进行杂交，鉴别出与转录有关的基因。基本原理生物性状和疾病→→由结构或功能蛋白质决定已知的蛋白质→→由mRNA编码mRNA反转录→合成cDNA→即EST的cDNA片段用这种稳定的cDNA或EST→→作为“探针”进行分子杂交鉴别出与转录有关的基因基本原理或用PolyA互补的寡聚T或克隆载体的相关序列作为引物对mRNA双端尾侧的几百个bp进行测序得到EST（表达序列标签）表达序列标签（EST）克隆测序获得EST基本过程细胞/组织高质量mRNA构建cDNA文库克隆3‘和5’端探针估计全长和复杂性杂交阵列文库克隆3‘和5’端全长候选基因纯化克隆证实5’端基因图谱的意义1、能为估计人类基因的数目提供可靠的依据。2、提供不同组织、不同时期基因表达的信息（数目、种类及结构功能）。3、提供结构基因的标记，可以作为筛选基因的探针，有直接的经济价值。4、鉴定病态基因（如癌基因）的变异位置。单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）人类是一个具有多态性的群体。不同的群体和个体在生物学性状（对疾病的易感性／抗性）上的差别，是进化过程中基因组与环境相互作用的结果不同个体间在基因水平上的单核苷酸变异，平均每1000对碱基出现一个SNP,2个无关个体间有300万SNPs.SNP作图的一般步骤包括：•①获取DNA序列；•②从DNA序列确定序列标签位点（sequencetaggedsites，STSs）；•③扫描STSs或ESTs确定候选SNPs；•④确定SNPs；•⑤将SNPs定位于染色体特定位置。特异杂交SNP不同于罕见的单碱基突变（Mutation）◆SNP等位位点出现的频率≧1％◆位于基因的编码序列中的SNP称为cSNP如果cSNP引起蛋白质重要部位AA变异导致其功能发生改变◆位于基因调控序列中的SNP影响基因的表达调控◆SNP因连锁不平衡所形成的单倍型用于关联研究（Associationstudies）确定与之联锁的生物学性状相关序列连锁分析与基因定位疾病的关联研究多基因疾病的基因定位个体识别和亲子鉴定发病机理的研究个体用药生物进化和生物间相互关系SNP应用【例1】镰刀型贫血症（sickle-cellanemia）血红蛋白的β珠蛋白基因17位的A突变为T导致Val变Glu血红蛋白构型改变携氧能力大大降低，引发严重贫血SNP与临床直接导致遗传病【例2】静脉血栓（venousthrombosis）凝血因子5（factorV）基因1691位的G突变为A导致Arg变为Glu封闭了抗凝血因子APC(activatedProteinC)对factorV的切割位点促使血栓形成关联分析（Associationstudies）：如果某一因素可增加某种疾病的发生风险即与正常对照人群相比该因素在疾病人群中的频率较高那么，该因素与疾病相关联如非遗传因素吸烟与肺癌相关遗传因素中，APOE4与Alzheimer`s相关SNP与遗传标记研究复杂性状与疾病的遗传，以及群体的基因识别[老年痴呆/阿尔海默症]遗传标记用于遗传分析或关联分析的特征核酸位点SNP数量多，分布广泛SNP适于快速、规模化筛查SNP等位基因频率的容易估计易于基因分型同样药物的剂量对病人甲有效对病人乙不起作用对病人丙则可能有副作用药物的疗效与副作用方面，病人的反应差异很大Why？？？病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性SNP）导致对药物产生不同的反应SNP与个体用药【例】细胞色素P450酶与大约25%广泛使用的药物的代谢有关如果病人该酶的基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用那么，查明病人的SNP图谱检测病人是那一个或多个基因发生突变对症下药→→→个体医疗。美国国立卫生研究院(NIH)提供（NationalInstitutesofHealth）★与癌症和肿瘤相关的候选SNP数据库：http:/