实验2—液相色谱法

仪器分析实验讲义02实验地点化学楼315实验学时3授课教师实验项目高效液相色谱法测定芦丁片中芦丁含量预习提要1.液相色谱分离原理；2.液相色谱分类；3.液相色谱定量分析方法；4.高效液相色谱仪基本构造及特点；5.反相色谱与正相色谱；6.内标法原理及应用范围;7.高效液相色谱仪操作基本步骤。实验报告部分一、实验目的与要求1.了解高效液相色谱仪的基本结构及基本操作；2.了解反相色谱法的基本规律；3.掌握利用内标法进行色谱定量分析的实验方法。二、实验原理1.液相色谱法：在液相柱色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。这种色谱法称为高效液相色谱法。主要分为四类，即液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱。其中液液分配色谱是根据不同组分在两种互不相溶的液相中的分配系数不同而实现分离的，流动相的极性小于固定相的化学键合相色谱称为正相色谱，流动相的极性大于固定相的化学键合相色谱称为反相色谱。反相色谱是目前最常用的液相色谱分离方法。如以C18烷基键合相柱，采用甲醇或乙氰的水溶液为流动相进行色谱分析。2.标准工作曲线法（外标法）：3.液相色谱仪基本构造(同学自行完成)三、仪器与试剂1.仪器：液相色谱仪、微量注射器、色谱柱(C18柱250mm×4.6mm)、紫外检测器(254nm)、超声波脱气机、抽滤装置一套2.试剂：甲醇(色谱纯)、超纯水、芦丁(对照品)、复方芦丁片四、HPLC基本操作(一)准备工作1.流动相处理：(1)流动相用真空泵抽滤：有机溶剂用有机膜过滤，水相用水膜或有机膜过滤。过滤时瓶子润洗，膜润湿。水过滤2遍，有机相过滤1遍。(2)过滤后装入流动相瓶中。2.开机与联机：开计算机开液相机器各个模块电源（从上到下或从下到上均可）（本次实验开从上到下4个模块：脱气装置，四元泵，柱温控制器，DAD检测器）开机后，计算机显示屏右下角显示“本地连接”桌面HPLC联机(二)冲洗系统（此时应关闭紫外氘灯）(1)打开冲洗阀（逆时针旋松即可，不可多旋，否则会漏液）；(2)A,B,C,D四个通道全放入水相溶剂瓶，单击泵图标，设置流速5ml/min，比例均为25%，确定，冲洗15min;(3)然后将A,B,C,D四个通道全放入甲醇溶剂瓶，单击泵图标，设置流速5ml/min，比例均为25%，确定，冲洗15min;(4)设置泵流速为0ml/min，结束冲洗。(三)流动相脱气——除去流动相中的气泡(1)打开冲洗阀;(2)设置泵参数：流速5ml/min.依次设置A/B/C/D的比例为100%，先水后盐再水后有机溶剂。每个通道，即每种流动相脱气5min;(3)关闭冲洗阀(脱气过程氘灯关闭)。(四)平衡色谱柱——紫外灯开(1)90%甲醇：10%水相冲洗30min，流速1ml/min(2)用测试样品条件的流动相冲洗柱子约30min，流速1ml/min，至色谱基线基本趋于平稳，大约正负0.2范围波动，即可结束平衡柱操作。若基线波动大，可点击平衡按钮调整。(五)进样方法设置——脱机模式中操作(1)建立方法——脱机：桌面HPLC脱机，“方法”“新建方法”(2)泵参数设定：流速设为实验条件值。0.8~1ml/min，A/B/C/D通道比例设为实验条件值(3)柱温箱参数设定：柱温(4)检测器参数设定：波长、带宽、峰宽等(5)“运行时选项表”“数据采集”(6)“方法”“方法另存为”——名称，保存(7)进样前调用该方法即可(六)进样——联机模式中操作(1)进样前，新建一个文件夹，以日期+名字或样品命名(2)视图菜单首选项，设定新建文件夹为数据路径，以保存数据(3)”运行控制”“样品信息”，添加样品信息，样品位置，文件名，保存路径(七)关机(1)所有样品测试完后，要将流动相冲出来，调用冲柱子的方法，冲洗30min。再用100甲醇冲洗柱子，流速为1ml/min.(2)退出色谱工作站，关闭计算机(3)依次（从下到上）关闭色谱仪各个模块电源五、实验步骤1.准备工作(1)流动相过滤;(2)冲洗柱子;(3)流动相脱气;(4)平衡柱子2.对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20mg,置100mL棕色容量瓶中,加甲醇适量,超声溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液,经0.45μm滤膜过滤后备用。3.供试品溶液的制备取复方芦丁片样品10片,研细,精密称取适量(约相当于芦丁25mg),各取3份,分别置于50mL棕色容量瓶中,加甲醇适量,超声溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀,经0.45μm滤膜过滤。精密量取续滤液2.5mL,置50mL容量瓶中,用流动相稀释至刻度后,摇匀,即得供试品溶液。4.色谱分析条件色谱柱18柱，流动相V(甲醇)∶V(0.1%冰醋酸)=60∶40,检测波长362nm,流速0.8mL·min-1,柱温35℃,进样量20μL,外标法计算含量5.分析项目(1)标准工作曲线及其线性关系精密量取一定量芦丁对照品溶液,用流动相稀释配制成质量浓度分别为12.500,25.000,50.000,100.000,150.000,200.000μg·mL-1的系列对照品溶液,依次进样并平行测定3次,采用最小二乘法以芦丁质量浓度(Y)对峰面积(X)作图,并进行线性回归,计算相关系数R；(2)精密度试验取芦丁对照品溶液1mL,置于10mL容量瓶中,加流动相稀释至刻度,按色谱条件连续进样测定6次,每次进样20μL,计算其峰面积的RSD;(3)芦丁含量测定取供试品溶液,按色谱条件进样测定,每次进样20μL,计算其峰面积，用外标法计算含量(4)重现性试验取供试品溶液,按色谱条件连续进样测定6次,每次进样20μL,计算其峰面积的RSD(5)加样回收率试验取供试品(约相当于芦丁25mg)各6份,分别精密加入芦丁对照品一定量,制成供试品溶液,进样测定,测得芦丁片的平均回收率和RSD。六、数据记录1.每个分析项目的数据表2.样品分析的色谱图七、实验注意事项1.检查流动相是否充足，储液罐要密闭；2.流动相有气泡要脱气，否则影响灵敏度；3.待仪器稳定后，再进样；4.进样器要充分洗涤；不可有气泡；2.实验完成后依次用纯水、100%甲醇洗涤20分钟。八、实验报告（结果与结论）1.相对校正因子；(f’=AsWi/AiWs)2.未知液中甲苯的含量。(Wi=f’*Ai’*Ws’*/As’)九、思考题1.流动相为什么要脱气？常用的脱气方法有哪几种？2.高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？十、实验学习与操作总结1.2.3.4.