显微摄影技术

显微摄影技术廖继东电话：[phone]E-MAIL:[e-mail]什么是显微摄影？显微摄影：利用摄影装置（传统相机、数码相机、专用CCD等）拍摄显微镜视野中所观察到的物像。影像质量取决于：–样本制作质量；–显微镜光学性能；–摄影装置性能；–操作者技术水平。内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄影有关的基本光学概念显微摄影系统的基本构成显微摄影基本操作程序影响显微成像质量的因素光学显微镜种类及结构特征按照其光路结构、分辨模式：–正置显微镜–倒置显微镜–体视镜–偏光镜等；按照其照明光源性质：–可见光（明视场、弱视场）–荧光（紫外、红外）显微镜–激光共聚焦显微镜–光谱显微镜；按机械部件的控制方式：–手动–电动和全自动显微镜。光学显微镜的种类及结构特征明视场（可见光）照明光源采用普通灯泡或卤素灯，主要用于常规染色组织标本的观察：–组织化学染色样本–免疫组织化学染色样本；弱视场包括相差（又称相忖）、霍夫曼、微分干涉和偏光等，照明光源与明视场通用，但在光路上插入不同的光学部件，降低背景光强度，增强被观察物体的光反差，提高对透明样本的观察能力，主要用于活组织未染色样本的观察。光学显微镜的种类及结构特征荧光显微镜：–照明光源采用汞灯或高能氙灯，通过不同的滤光片组合获得不同波段的激发/发射光，用于荧光染色标本的观察。–由于冷光源技术（金属卤素灯）的开发及荧光蛋白技术的日臻成熟，已逐渐克服了强光源对组织的灼伤及活组织荧光显色等技术瓶颈，使荧光显微技术在活组织样本观察中获得了广泛的应用。光学显微镜的种类及结构特征激光共聚焦显微镜：–利用单色高能激光对观测样本进行逐点、多焦面扫描，通过计算机处理合成高清晰图像。光谱显微镜：–采用多滤片组合或分光技术，获得连续激发/发射光谱，用于荧光扫描、荧光萃灭、荧光能量转移等细胞动力学观察内容光学显微镜的种类及结构特征光学显微镜主要光学部件及性能与显微摄影有关的基本光学概念显微摄影系统的基本构成显微摄影基本操作程序影响显微成像质量的因素光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数透镜及其性能透镜（lens):透镜是由透明物质（如玻璃等）制成的一种光学元件。透镜是折射镜，其折射面是两个球面，或一个球面一个平面。它所成的像有实像也有虚像。透镜一般可以分为两大类：凸透镜和凹透镜。中央部分比边缘部分厚的叫凸透镜，有双凸、平凸、凹凸三种；中央部分比边缘部分薄的叫凹透镜，有双凹、平凹、凸凹三种。凸透镜具有会聚光线的作用，所以也叫会聚透镜。凹透镜具有发散光线的作用，所以也叫发散透镜。透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜、目镜及聚光镜等部件均由单个或多个透镜组成。虚像/实像：光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。焦点与焦平面：当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称“焦点”；通过交点并垂直光轴的平面，称“焦平面”。焦点有两个，在物方空间的焦点，称“物方焦点”，该处的焦平面，称“物方焦平面”；反之，在像方空间的焦点，称“像方焦点”，该处的焦平面，称“像方焦平面”。光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数显微镜的成像原理a.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像；b.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像；c.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像；d.当物体位于透镜物方焦点上时，则像方不能成像；e.当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚像。显微镜的成像原理就是利用上述（c）和（e）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前F-2F（F为物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上，将此像落在目镜的一倍焦距F1之内，使物镜所放大的第一次像（中间像），又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方（中间像的同侧）、人眼的明视距离（250mm）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，当我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像于原物体的像，方向相反。光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数影响成像的关键因素—相差色差（Chromaticaberration）：色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在以多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。白光由红橙黄绿青蓝紫七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察，都带有色斑或晕环，使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩色边缘。球差(Sphericalaberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑。从而影响成像质量。球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的补偿目镜配合，才能达到纠正效果。一般新型显微镜的球差完全由物镜消除。慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色相差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则一光点的像便会得到一逗点壮，型如慧星，故称“慧差”。像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色相差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来消除。场曲（Curvatureoffield）：场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时看清整个相面，给观察和照相造成困难。因此研究用显微镜的物镜一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。畸变（Distortion）：前面所说各种相差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真。光学显微镜主要光学部件及性能透镜及其性能显微镜的成像原理影响成像的关键因素—相差主要光学部件及性能光学显微镜相关参数主要光学部件及性能物镜（objective）:物镜是显微镜最主要的光学部件，显微镜的分辩力主要取决于物镜的数值孔径（镜口率，numericalaperture,NA）。目前常见物镜：消色差物镜、复消色差物镜、半复消色差物镜、平场消色差物镜。数值孔径(NA)数值孔径（numericalaperture,NA），是物镜和聚光镜的重要技术参数，是判断光学元件性能的重要标志。它是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(η(Eta))和孔径角(u(upsilon))半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=ηsinu/2。消色差物镜（achromaticobjective,Ach）。这是一种常见的物镜，物镜外壳上不列代表标志。物镜把光谱中红蓝光聚焦于一点，黄绿光聚焦于一点，最清晰范围为510～630纳米。这种物镜一般不适宜作摄影用，如加黄绿滤光镜，可获得较为清晰的照片。复消色差物镜（apochromaticobjective,Apo）。这种物镜能把光镜中红、蓝、黄光聚焦于一点，纠正了红蓝光的色差和黄绿光的球差，最佳清晰范围为400～720纳米。这种物镜适用于在任何色光下或加用各色滤色镜进行观察摄影，适用于彩色摄影。但Apo物镜残留有像场弯曲，使平面物体形成类似球面的弯曲影像，结果使视野中心和边缘的影像不能同时聚焦，拍出的底片中心清晰，边缘模糊或者相反。半复消色差物镜（荧光石镜，fluoriteobjective,Fl）。最佳清晰范围430～680纳米，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间。平场消色差物镜(planachromaticobjective,lp)。这种物镜纠正了以上三种物镜的缺陷，校正了像场弯曲，不存在视野中心与边缘不能同时准焦的现像。由于影像展开，在同样倍数下，影像要比一般物镜的影像大。平场消色差物镜有多种类型，外壳上刻有plan.Apo。平场复消色差物镜是最佳物镜。物镜标识物镜色差程度：Apo(复消色差物镜)Fl(荧石物镜)plan或pl(平场消色差物镜)。放大倍数/数字孔径：2.5，4（5），10/0.25，20，40/0.65，63，100/1.25。标准机械筒长：160mm或170mm。盖玻片厚：0.17mm，常以170mm/0.17mm表示，载玻片厚小于1.2mm。物镜与被检样品的介质：干燥系物镜无标志；油浸镜标有OIL、OEL、HL或IMM字样；水浸镜标为W；甘油为Glyz。目镜(eyepiece)目镜是位于实像和肉眼间的放大镜，将物像进行第二次放大，并纠正物镜造成的像差和色差。目镜由两片（组）透镜组成，其中，场透镜可使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮，眼透镜决定放大倍数和成像的优劣。目镜筒内装有以金属光阑，物镜放大后的中间像就落在金属光阑平面处。从目镜中透出来的光线在目镜外相交，这个相交点称为眼点（eyepoint）。观察时眼睛应在眼点位置上，这样才能接收从目镜射出的全部光线，看到最大的视场，否则会造成图像晃动和不适的感觉，影响观察效果。目镜(eyepiece)由前述已知显微镜的分辨能力是由物镜的数字孔径所决定的，而目镜只是起到放大作用。因此，对于物镜不能分辩出的细微结构，目镜放得再大，也仍然不能辨认。目镜有标准型和广视场型。按用途又分为观察目镜、照相目镜和取景目镜。照相目镜专供显微照相之用，它是一种负焦目镜，眼点位于目镜内，因而不能用于观察。它的特点是视场平坦，可校正物镜的残留色差，使投射到感光片（或CCD）上的图像四周与中心都尽可能在一个焦点平面上。照相目镜用于显微照相，其放大率不高，一般在2.5～6.7倍之间。照相目镜外侧或端面刻有“PHOTO”、“FK”、“NFK”字样。目镜与物镜的组合物镜放大倍数1040100物镜数值孔径0.250.651.25有效放大倍数125～250325～650625～1250目镜放大倍数12.5～258～166～12.5显微镜的有效放大率为所用物镜数值孔径的500～1000倍。目镜与物镜组合前提是使放大倍数在有效放大率范围内。在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合当所选目镜的放大倍数低于有效放大倍数时，会造成物镜本来可以辨认的细节因总的放大倍数太小而挤在一起，难以分辩。当所选目镜的放大倍数高于有效放大倍数时，所得放大倍数叫“空的放大”，影像细节的分辩能力没有提高。–在有效放大率前提下，要提高对物像细节的分辩能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜和低倍目镜的组合。目镜和物镜的组合例如数值孔径为1.3的物镜（标记为100/1.3）与放大倍数为4的目镜组合，总放大倍数为400，若入射光为绿色光（550纳米），分辩力为270纳米。数值孔径为0.65的物镜（标记为40/0.65）与放大倍数为10的目镜组合，总放大倍数为400，λ＝550纳米时分辩力为500纳米。两种组合结果，显然第一种能提高物像分辩力。不同照像目镜/物镜组合的效果照像目镜的选择：在物镜的有效放大倍率内，尽量优