第六章-荧光光谱法.

第六章荧光光谱法123分析方法荧光分光光度计基本原理4应用与示例要求掌握基本原理熟悉仪器基本构造了解定量方法FL物质分子/原子吸收光子能量被激发，然后从激发态最低振动能级返回到基态时所发射出的光Fluorescence根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法Fluorometry有些物质的分子在用紫外-可见光激发时，能发射荧光，由此建立的分析方法MolecularFluorometry61.灵敏度非常高：检出限可达10-10~10-12g/ml2.选择性好优点基本原理分子荧光的产生荧光光谱的特征影响荧光强度的因素81.分子的电子能级与激发过程2.荧光的产生分子荧光的产生基本原理基态单重态单重态三重态（tripletstate）（singletstate）激发态M=2S+1=1（S=0）M=2S+1=3（S=1）禁阻跃迁1.分子的电子能级与激发过程基本原理10光致发光的分子能级示意图各个不同振-转能级基本原理11辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式）电子：激发态→基态2.荧光的产生振动弛豫内部能量交换荧光的发射（辐射）外部能量交换体系间交叉跃迁磷光的发射（辐射）基本原理1.激发光谱和发射光谱2.荧光光谱特征荧光的光谱特征基本原理荧光：先激发后发射发射光谱激发光谱不同激发波长引起某一波长荧光发射相对效率固定发射波长扫描激发波长固定激发波长扫描发射波长发射荧光中各波长相对强度1.激发光谱和发射光谱（excitationspectrumandemissionspectrum）基本原理14激发λ、ε荧光λ图形激发光谱变不变F~λex图发射光谱不变变F~λem图作用：1.鉴别荧光物质2.选择适当测定波长基本原理15激发光谱及荧光光谱A-激发光谱；F-荧光光谱基本原理16斯托克斯位移荧光光谱形状与λex无关荧光光谱与激发光谱互为镜像2.荧光光谱特征基本原理17•溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于激发光谱波长的现象•说明在激发与发射之间存在能量损失1）斯托克斯位移（Stokesshift,1852年）振动弛豫内部转换基本原理18•内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至S1*的最低振动能级→荧光发射光谱只有一个发射带•荧光发射通常发生于S1*最低振动能级，与激发至哪一个电子激发态无关→荧光光谱形态与λex无关2）荧光光谱形状与λex无关基本原理19•电子基态振动能级分布与激发态相似→ΔE相同•小峰间Δλ与振动ΔE有关，强度与跃迁几率有关3）荧光光谱与激发光谱互为镜像基本原理20蒽的能级跃迁基本原理21蒽的激发光谱及荧光光谱S0→S2*基本原理221.荧光产生的条件2.影响荧光强度的结构因素3.影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的因素基本原理231）荧光寿命（fluorescencelifetime）1.荧光产生的条件•除去激发光源后，分子荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e（~37%）所需的时间•常用τf表示•荧光物质重要的发光参数之一•τf的计算-作图法（p135）基本原理24•激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示：•φf：0~1•φf大→有荧光发射2）荧光效率（fluorescenceefficiency）基本原理吸收激发光的光子数发射荧光的光子数f25•例如:荧光素钠在水中φf=0.92荧光素在水中φf=0.65蒽在乙醇中φf=0.30菲在乙醇中φf=0.10基本原理263）产生荧光的条件分子必须有强UV-Vis吸收有一定的荧光效率能量以无辐射跃迁形式释放（内转换与外转换的速度很快）→无荧光发射否则基本原理271）跃迁类型2）共轭效应（长共轭结构）3）刚性结构与共平面性效应4）取代基效应2.影响荧光强度的结构因素（内部因素）基本原理28•分子结构中存在共轭的π→π*跃迁，也就是K带强吸收时，才可能有荧光发生1）跃迁类型基本原理29•π电子共轭程度↗：荧光强度（荧光效率）↗、荧光波长↗（长移）eg:苯萘蒽λex(nm)205268356λem(nm)278321404φf0.110.290.362）共轭效应（长共轭结构）基本原理30•同样的长共轭分子：分子刚性和共平面性↗，荧光率↗，荧光波长↗3）刚性结构与共平面效应8-羟基喹啉8-羟基喹啉镁芴基本原理31①增加分子π电子共轭程度-含孤电子对的杂原子基团→荧光波长长移②减弱分子的π电子共轭性-吸电子基团→荧光减弱甚至熄灭③对π电子共轭体系作用较小→对荧光的影响不明显4）取代基效应基本原理321）温度的影响2）溶剂的影响3）pH值的影响4）荧光熄灭剂的影响5）散射光的影响3.影响荧光强度的外部因素基本原理331）温度：温度升高→荧光物质的荧光效率和荧光强度下降原因-分子运动速率↗→碰撞概率↗→无辐射跃迁↗2）溶剂：极性↗，荧光波长↗，荧光强度↗原因-π→π*的ΔE↘→跃迁几率↗→紫外和荧光波长↗粘度↗，荧光强度↗（和温度有关）原因-分子碰撞概率↗→无辐射跃迁↗基本原理343）pH值的影响荧光物质本身是弱酸或弱碱有较大影响4）荧光熄灭剂：①引起荧光熄灭的物质②荧光熄灭（猝灭）指荧光物质分子与溶剂/溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象③荧光熄灭的形式：a.碰撞-荧光自熄灭（溶液浓度过高时）b.生成不发光配位化合物c.荧光物质氧化基本原理35荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强度减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系荧光熄灭法（fluorescencequenchingmethod）利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量基本原理365）散射光的影响：瑞利散射拉曼散射：产生能量损失的拉曼散射影响最大-原因：波长与荧光波长相近-措施：选择适当的激发波长λex（表6-1）硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱基本原理主要部件仪器的矫正荧光分光光度计38荧光分光光度计39荧光分光光度计由激发光源、激发单色器和发射单色器、样品池、检测器及读出系统组成荧光分光光度计主要部件40荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计411.激发光源•高压氙灯——强谱线的连续光谱连续分布在250~700nm波长范围内300~400nm波长之间的谱线强度几乎相等•汞灯——线光谱高压：近紫外区（365,398,405,436,546,579nm）低压：紫外区（最强254nm）荧光分光光度计422.单色器（两个）•激发单色器置于光源和样品池之间除去不需要的光线——获得单色激发光•发射单色器置于样品池和检测器之间选择不同的荧光发射波长——消除杂散光影响荧光分光光度计433.样品池•低荧光的玻璃或石英•方形—散射光较少•90o测量—消除入射光的背景干扰荧光分光光度计444.检测器•主要：光电倍增管•其他：二极管阵列（色谱）、电荷转移（电泳）•冷却—改善信噪比S/N荧光分光光度计455.读出系统•数字电压表•记录仪•微机荧光分光光度计仪器的矫正影响因素众多以被检出的最低信号表示标液矫正-硫酸奎宁的检出限/纯水拉曼峰的S/N灵敏度激发/荧光光谱波长以汞灯的标准谱线对单色器刻度进行校正采用双光束光路以参比光束抵消误差荧光分光光度计47•定性分析•定量分析分析方法48•依据：定性分析特征光谱激发光谱荧光光谱•方法：对照品对照类似于紫外-可见光谱法，但特征性更强分析方法491.荧光强度与浓度的关系2.定量分析方法定量分析尤其适合于痕量物质含量测定分析方法荧光物质受到激发发射荧光吸收光能释放能量溶液荧光强度与吸收光能程度荧光效率有关分析方法511.荧光强度与浓度的关系0()FK'II010clII0002.3000()(10)()2.3clclFK'IIK'IIK'IIeK'Illcckc0.05（≤，即稀溶液）荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度：L-B定律：定量基础分析方法52荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度改进光电倍增管和放大系统灵敏度极高vs紫外-可见分光光度法：A(-log(I/I0))-c关系放大光强信号时入射光和投射光同时放大比值不变灵敏度不变分析方法531.标准曲线法2.比例法（对比法、一点外标法）3.多组分混合物的荧光分析4.差示荧光法2.定量分析方法类似于UV-Vis分析方法54FL与UV比较λ区段：UV-Vis区适用性：均可用于定性定量，多用于定量定量方法：相似样品性质:以液体为主用量：少分析时间：快操作难易程度：易相同点分析方法55UVFL性质分子吸收光谱分子荧光光谱应用范围广荧光的物质，较少选择性不高高灵敏度g/ml10-710-10~10-12仪器观察角度透射光90°谱线数目12不同点分析方法56直接荧光法制备荧光衍生物化学引导荧光荧光熄灭法胶束增敏荧光分析法应用与示例荧光分析法在药物研究中的应用57荧光新技术激发荧光分析时间分辨荧光分析同步荧光分析应用与示例