质粒转化大肠杆菌实验

实验2质粒转化大肠杆菌目的1．重组质粒的鉴定当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，或者不含插入片段的质粒自身环化，抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力，可以在含该抗生素的培养基上生长传代。不然，假如重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2．为扩增质粒和其它载体作准备由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。*作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。原理本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106-2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备（参考教材）实验步骤自-70℃冰箱中取出感受态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约5分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。细菌50ulDNA5ul轻轻混匀，静置冰上30分钟。于42℃水浴中热休克细菌90秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ulLB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取100ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。1.无菌落，失败。或培养条件不充分。2.菌落布满如苔样，失败，可能是抗生素浓度不够或失效。3.菌落布满，浓度太高，失败。4.出现菌落，符合要求。结果分析及处理办法1、有菌落，说明转化成功，但有两种可能性。其一，质粒自身环化；其二，重组成功。2、无菌落，说明实验1，2中，至少有一个实验没有成功。3、菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够或失效。4、出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。注意事项1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂板含有抗生素，所以当实验环境干净者，可以直接放在普通实验台上操作。3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验室经验的研究人员，我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒，这样由于L型的下端与琼脂板的接触面大，不易将琼脂板划破。4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等，倒置放入培养箱。5．感受态大肠杆菌的制备：（1）在无污染的条件下，用LB扩增大肠杆菌，并离心收集。（2）4℃条件下，用0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，再离心沉淀，以洗去LB培养液。（3）4℃条件下，用0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，分装备用。大约50ml的LB培养液的大肠杆菌，溶于2ml的CaCl2中（每mlLB培养液大约含108成活的大肠杆菌，LB培养的菌落要求划皿约16-20小时的菌落）。6．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不使用玻璃器皿，以免降低转化效率；7．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高转化效率；8．在整个实验过程中，要注意冰上操作。