细胞传代、换液、给药和种板

细胞传代[实验器材]0.25%胰酶、胎牛血清、F-12培养基、PBS、培养瓶、5ml白枪头、15ml、50ml离心管[实验步骤]1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；2、将培养基、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，5、用适量PBS清洗细胞表面，并弃去PBS；6、加入适量胰酶消化细胞，此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消化；待消化完全后，用胰酶2倍体积的完全培养基中止消化，将细胞移入离心管1000rpm，5min离心；7、弃上清，加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱；8、收拾物品，整理实验台，做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，30min后关闭细胞的换液[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)[实验步骤]1、将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。2、用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。3、将细胞拿出，吸去培养基，用3mlPBS洗2次，各瓶加入4ml血清培养基。4、整理洁净台！细胞的给药[实验器材]培养基、胎牛血清、50ml离心管、5ml白枪头、PBS(白枪头、离心管提前高压)、皮质酮、咖啡因[实验步骤]1.将培养基、PBS、离心管放入超净工作台，紫外灯照射30min。将胎牛血清从-20℃放入37℃水浴锅内，完全溶解后拿出。2.用50ml离心管配置适当浓度的血清培养基。3.在15ml离心管中配置皮质酮及咖啡因浓度梯度。4.按2ml/孔加入6孔板中，做好标记。5.收拾物品，整理工作台。细胞种板[实验器材]试剂：PBS、培养基、胎牛血清、双抗、胰酶(含EDTA)、75%酒精仪器：无菌枪头（蓝、白、黄）、移液枪（1000ul、5000ul、100ul、50ul）、15ml离心管1个、1.5ml离心管、封口膜、六孔板2个（一瓶一般种两板）、细胞计数板、手套、口罩、帽子。仪器处理：1.操作器械及试管枪头高压灭菌（123度、30min）2.无菌操作台紫外灭菌30min[实验步骤]1.（倒液）倒去培养基，并用5mlPBS洗涤两遍；2.（消化）加入1ml胰酶溶液（培养皿2ml），用力晃动培养瓶30s左右，并放入培养箱中3min左右，镜下观察消化情况，达到80%以上即可；3.（终止）加入2ml（比胰酶多1ml）带血清培养基终止消化；4.（吹打）枪头调至1ml吸取细胞液吹打，促使细胞脱落；5.（离心）将已消化的细胞液吸至15ml离心管中，离心（1000r/min）8min后，倒去上清；6.（混匀）离心管中加入4ml（2-5ml）培养基，充分混匀；7.（计数）吸取10ul细胞液+90ul细胞染液至1.5ml离心管中，充分混匀后吸取10ul至细胞计数板上，镜下进行计数；细胞数/ml=（四个角的细胞总数）100小格内酵母细胞个数/100×400×10^4×稀释倍数(10)细胞总数=（四个角细胞总数）/4×10^5×(第6步加入培养基量ml)8.（种板）根据细胞数量加入适量培养基进行稀释，要求每孔加入细胞液2ml，细胞数目30万/孔(6孔板)，96孔板为1万/孔。