第4章-蛋白质一级结构测定

第四章蛋白质结构测定◆数年后，美国科学家Moore和Stein改进了Sanger的方法，完成了第一个酶蛋白——核糖核酸酶的序列分析。◆1955年英国科学家F·Sanger发表了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，开创了研究蛋白质一级结构的新纪元。这是分子生物学发展进程中的一个重要突破。第四章蛋白质一级结构测定第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析第三节末端氨基酸的测定第四节肽链的专一性水解和肽段的分离纯化第五节肽段的序列测定第六节由已知序列肽段建立蛋白质一级结构第七节蛋白质一级结构研究进展第一节蛋白质序列测定的基本策略和步骤一、序列测定的基本策略二、序列测定前的准备工作三、序列测定的一般步骤一、序列测定的基本策略1.两种或两种以上的特异性裂解法2.逐级特异性裂解战略考虑关键一是多肽链片断裂解方法的选择；二是裂解后肽段的分离纯化；三是要寻找接头肽段。二、序列测定前的准备工作（一）样品的纯度要求（二）蛋白质的分子量测定（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小（四）蛋白质的氨基酸组成（五）蛋白质的配基（六）蛋白质的末端分析蛋白质一级结构测定(重点)指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。测定的基本步骤：（一）．测定蛋白质纯度、分子量和浓度（二）．进行末端分析，确定蛋白质的肽链数目及N-端和C-端氨基酸的种类（三）．拆开二硫键并分离出每条多肽链（四）．分析每条多肽链的N-末端和C-末端残基组成和摩尔数（五）．用两种不同方法将肽链专一性地水解成两套肽段并进行分离，以获得单一的碎片（六）．比较各个肽段的氨基酸排列顺序并拼凑出完整肽链的氨基酸排列顺序（七）．二硫键和酰胺基位置的确定（一）样品的纯度要求一般要求纯度在97％以上，杂蛋白含量超过5％时便很难测定序列。常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：①双向分析电泳；②变性聚丙烯酰氨凝胶电泳；③离子交换层析；④N—末端氨基酸的测定；⑤亲和层析；⑥纯化至恒定比活；⑦肽（酶）谱分析；⑧Western印渍法等。（一）测定蛋白质纯度、分子量和氨基酸组成1、样品的纯度与分子量纯度＞97%；测定方法：（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶知识丙烯酰胺（acrylamide），甲叉双丙烯酰胺（methylenebisacrylamide）聚合而成；凝胶孔径：选择丙烯酰胺浓度，甲叉双丙烯酰胺胶联剂的浓度；凝胶有分子筛效应。SDS-PAGESDS（sodiumdodecylsulfate）阴离子洗涤剂，几乎能破坏天然蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率（migrationrate）的影响；SDS以1:2的比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，而且电荷量与蛋白质分子量（即肽链长度）成正比。所以分子量成为决定蛋白质迁移率的唯一因素。SDS-PAGE•SDS-PAGE分离的蛋白质可以用Coomassieblue染色，也可银染（silverstain）•SDS-PAGE能分离分子量差异小于10%的蛋白质•用于蛋白质纯化和分子量近似值测定（2）等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）在凝胶上加入一种两性电解质（ampholyte），电泳时会形成连续的pH梯度电泳后，各种蛋白质停留在与其等电点（pI）相同的位置IEF能分离pI值仅相差0.01的蛋白质（即一个净电单位）不连续电泳的三种效应：浓缩效应，分子筛效应电荷效应（3）双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）双向电泳=IEF+SDS-PAGE第一向：根据电荷差异用IEF分离第二向：根据分子量差异用SDS-PAGE分离IEFSDS-PAGE每一个点代表一条多肽链，每一条多肽链有自己的等电点和分子量。多肽链可以用染色法或放射自显影进行检测（4）其它方法•离子交换层析（根据物质所带电荷进行分离）•亲和层析（利用蛋白质与与其他分子的结合特异性）•Ｎ－末端氨基酸测定•纯化至恒定比活•肽（酶）谱分析•Western印迹法（由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成）2、浓度测定紫外吸收法①蛋白质（ug/ml）＝（1.45A280一0.74A260）X稀释倍数②显色法双缩脲法：Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定Lowry法即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物（双缩脲反应），然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物，于７００nm下达到最大吸收峰。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大考马斯（Comessie)亮蓝结合法原理：考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜干扰物质较少（二）蛋白质的分子量测定常用的测定方法有：1.渗透压（osmoticpressure）2.沉降平衡（sedimentationequilibrium）3.凝胶过滤法；4.SDS—聚丙烯酸胺凝胶电泳法5.激光解吸电离飞行质谱法分子量测定公式：π/c=RT/M+KcⅠ.渗透压（osmoticpressure）π：渗透压c：溶质浓度R：气体常数T：绝对温度M：分子量•同时测定几个不同浓度的渗透压，以π/c对c作图并外推到蛋白质浓度为零，得截距，从而求出M。•为避免pH值的影响，在溶解度允许的范围内，尽量采用等电点或接近等电点的缓冲液，并增加溶液中无机盐的浓度。•可以测分子量在1－10万范围的蛋白质。•实验装置简单，准确度高。但不能区别溶液中蛋白质分子是否均一。Ⅱ.沉降平衡（sedimentationequilibrium）公式：M=2RTln(c2/c1)(1-vρ)ω2(x22-x12)x：蛋白质界面到旋转中心的距离c：x处的蛋白质浓度ρ：溶剂的密度ω：角速度v：蛋白质的偏微比容•用较低的速度离心（8,000~20,000r/min）•离心开始后，颗粒发生沉降，造成浓度梯度，同时产生扩散作用。扩散力与离心力作用方向相反，相互平衡11gM=A-BVeB为斜率，A为截距。当条件一定时，B与A均为常数2A-BB为斜率，A为截距。当条件一定时，B与A均为常数3分子（三）构成蛋白质的多肽链的数目和大小1.若肽链之间非共价交联，可用高浓度变性剂（如8mol／L尿素或6mol／L盐酸胍）变性拆离2.若肽链是由二硫键共价交联，可用过量的巯基乙醇等断裂二硫键，同时加变性剂，并保护生成的巯基拆开二硫键方法之一—过甲酸氧化法•为避免副反应，一般在－10℃下进行反应，但Trp仍被破坏，Met氧化成亚砜。此法的优点是，切断二硫键后，不能重新形成二硫键，便于肽键分离。★用得最多的还原剂是巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇、连四硫酸钠等。★为使反应完全，还原剂要过量，同时在反应体系中加入变性剂（SDS、脲、胍等）。在烷基化之前，还原的巯基要用N2保护。★用碘乙酸（或其酰胺），环乙烯亚胺封闭新生成的巯基，使巯基烷基化避免二硫键重新形成。巯基保护—还原-羧甲基化法(四)蛋白质的氨基酸组成（五）蛋白质的配基（六）蛋白质的端基分析三、序列测定的一般步骤正常的序列测定包括以下步骤：1.先是根据肽段大小和氨基酸组成情况选择合适的裂解肽段试剂，将多肽链裂解成一系列小肽，并分离纯化这些小肽段；然后测定每一肽段的氨基酸序列；2.另取一份样品，用第二种方法裂解多肽链（切点位置与第一次不同），分离纯化各肽段后，测每一肽段的氨基酸序列；3.最后比较已测得的两套肽段的序列，找出前后两次断裂点相重叠的部位，即接头部位，即可排出多肽链完整的氨基酸排列顺序。对于一次不能连续测出序列的大肽段，还需继续裂解成小肽，并分离纯化，分别测出这些次级肽段的序列。若多肽链含有二硫键或其它配基，如酰胺基时，还需分别确定它们在序列中的连接位置。第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析一、蛋白质的水解二、氨基酸的分离和定量测定三、特殊氨基酸的测定一、蛋白质的水解（一）盐酸水解法（二）磺酸水解法（三）酶水解法能较满意地得到除Trp和Cys以外的其它所有氨基酸（一）盐酸水解法•盐酸水解是目前水解蛋白质或多肽应用最广泛的一种方法。用此法能较满意地得到除Trp和Cys以外的其它所有氨基酸，方法也较为简便。•存在的问题使用重蒸5.7mol／L恒沸点盐酸，在密封的水解管中，于105～110℃进行蛋白质水解。水解时间一般在24～72小时。结果，大部分氨基酸可定量回收；但是，Trp基本上全被破坏，必须用其它方法测定；Ser和Thr缓慢分解，要准确测定，需要做几个水解时间实验；含Val和Ile的肽键，由于支链的空间障碍而水解缓慢，所以，定量测定就要长时间水解；Cys可被部分破坏和氧化，所以最好在氧化成稳定的磺基丙氨酸后测定；Gln和Asn在酸水解时脱酰胺后全部变成Glu和Asp，水解时放出的氨量可用来测定Asn和Gln的总量，或者用不水解酰胺的方法水解肽键后直接测定。盐酸水解时，Met易被氧化转变为甲硫氨酸砜，损失约20％左右，可以用这一数值进行校正，也可用保护剂（在盐酸中加入0.l～1.0％巯基乙酸）来减少水解中Met的损失;Tyr的破坏率约为10％，如水解时加入0.l～1.0％巯基乙酸和0.05～0.l％苯酚，能使Tyr和Ser回收率明显提高，这时Met也能免遭破坏。碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。（二）磺酸水解法•用4mol／L甲基磺酸，内含0.2％β—吲哚基乙胺（色胺）作水解剂，可使Trp的回收率达到90％以上，Ser和Thr的回收率接近定量值。其中Cys可用二硫苏糖醇还原水解液中的胱氨酸及其衍生物，然后用过量的连四硫酸钠氧化，得到S—磺基半胱氨酸而加以测定。•磺酸水解也有局限性，当水解液中存在碳水化合物时，色氨酸容易破坏，因此对含有较多碳水化合物的糖蛋白分子不能用本方法测定色氨酸。本法的最大优点是中性水解液可直接上机，色氨酸较稳定（三）酶水解法•选用专一性低，水解酶活力高的蛋白酶水解。•主要缺点：不易达到彻底水解，影响氨基酸的回收率；蛋白酶自溶产物会污染水解的氨基酸混合物。目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。二、氨基酸的分离和定量测定当前使用最普遍、最有效的是以离子交换层析法为基础研制的氨基酸自动分析仪，也有用HPLC的。使用的柱材料是磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂。在pH2.0的条件下，全部氨基酸都能牢固地结合在树脂上。提高洗脱液的pH和离子强度，可将氨基酸依次洗脱下来，从而达到分离的目的。洗下的氨基酸与茚三酮反应形成紫色产物Ruheman紫，可于570nm比色测定。但Pro与茚三酮反应形成的产物为黄色，于440nm比色测定。分离定量测定17种标准氨基酸混合液在日立835—50型氨基酸自动分析仪上的分析图谱三、特殊氨基酸的测定（一）色氨酸（Trp）的测定（二）巯基测定（三）二硫键的测定（四）氨基的测定（一）色氨酸（Trp）的测定1．紫外吸收法2．对—二甲基氨基苯甲醛法Trp在强酸条件下与醛反应生成带色产物。颜色的深浅与Trp含量成直线关系。该带色物质的最大吸收峰位