PLFA-测定操作规程(修改)

PLFA测定操作规程仪器设备：名称规格数量用途烘箱**1测定土壤含水量冷柜4℃1暂存土壤样品冷柜-20℃1用于土壤样品的长期保存及2-3天内待检测样品的保存冷柜-80℃1保存3天以上的待检测样品通风橱中1试验各步骤均需在通风橱中进行分析天平1/100001称样及测定含水量振荡器可调速1提取超速离心机最高转速〉5000r/min1提取氮吹仪DC-121浓缩提取液萃取收集器12孔SUPELCOVISIPREPTMDL1纯化（获取PLFA）真空泵10-30Pa25L/min1加速淋洗速度水浴锅恒温1甲醇分解微量加样枪200ul1移液微量加样枪500ul1移液微量加样枪1000ul1移液微量加样枪5000ul1移液移液瓶6ml1移液移液瓶12ml2移液移液瓶23ml1移液实验耗材:名称规格数量用途铝盒中号24测定含水量离心管50ml24提取分液漏斗250ml24萃取样品溶液的酯类物质大试管A35ml24盛装分液漏斗分离的总酯提取液大试管B10ml24盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液大试管C5ml24盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液萃取小柱3mlor6ml24纯化PLFA枪头5ml10移液枪头1ml5移液枪头500ul30移液枪头200ul60移液丙腈橡胶手套中号2实验操作时须戴橡胶手套厚2清洗容器时须戴纱布卷1罩容器试剂瓶时用注：数量以24个样品计。实验试剂（以24个样品计）：名称规格最低用量正己烷分析纯120ml三氯甲烷分析纯840ml甲醇优级纯720ml丙酮优级纯240ml甲苯优级纯12ml氢氧化钾优级纯24ml0.2MKOH醋酸优级纯7.2ml1MCH3COOH磷酸优级纯530ml超纯水48ml注：未计清洗用量和配试剂用量。试剂:1、磷酸缓冲液[c(K2HPO4)=0.05mol·L-1]：38.84gK2HPO4加入12mlCHCL3再加入超纯水稀释到4000；2、提取液[v（甲醇）：v（三氯甲烷）：v（磷酸缓冲液）=2：1：0.8]：526mlCH3OH加入263mlCHCL3再加入210ml磷酸缓冲液；3、甲醇甲苯混合液[v（甲醇）：v（甲苯）：=1：1]：取100ml甲醇和100ml甲苯混合；4、甲基化醋酸[c(CH3COOH)=1mol·L-1]：4.60mlCH3COOH加入80ml超纯水；5、甲基化氢氧化钾[c(KOH)=0.2mol·L-1]：28.05gKOH溶解于1000ml超纯水中为0.5MKOH溶液，再取40ml0.5MKOH溶液加入60mlCH3OH为0.2MKOH溶液。PLFA提取操作流程：实验前准备工作1、土壤过2mm筛，用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块；2、20克左右土壤样品置于铝盒中，称盒+鲜土重105烘干，称盒+干土重计算土壤含水量；3、配制试剂，准备实验用品。注意：所有玻璃器皿（试管、小瓶及瓶盖等）在实验前均须用正己烷清洗，晾干。实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。○1称取相当于8g干重的土壤，置于35ml离心管中○2向离心管中加入5ml磷酸缓冲液（用5ml移液枪，将含水量计入），再加入6ml三氯甲烷，12ml甲醇（用移液瓶）○525℃，3500rpm,离心10分钟○7加入23ml提取液于离心管中的剩余土壤中，手工摇动○8振荡30分钟○925℃，3500rpm,离心10分钟实验第一天○3振荡2小时○4加12ml三氯甲烷，12ml磷酸缓冲液于分液漏斗中○12摇动2分钟，静置过夜○6上层离心液倒入分液漏斗○11下层加水，摇动，丢弃多余土壤，用清洗剂洗刷离心管○10上层离心液倒入分液漏斗○13将分液漏斗中下层溶液放入大试管A中○22加1ml1:1甲醇：甲苯，1ml0.2M氢氧化钾溶液，摇匀○2337℃水浴加热15分钟○24加0.3ml1M醋酸溶液，2ml己烷，2ml超纯水○25低速振荡10分钟○27下层加2ml己烷，再振荡10分钟○26上层己烷溶液移入小瓶○28上层己烷移入小瓶实验第二天○1430-32℃水浴，N2浓缩○165份200微升三氯甲烷转移浓缩磷脂到萃取小柱（用250或500微升移液枪，第1-2次转移时直接从试管底部吸取，第3-5次转移时则在转移前用移液枪冲洗试管内壁。○15加3ml三氯甲烷调节萃取小柱（5ml移液枪）○17向萃取小柱加入5ml三氯甲烷○18加2次5ml丙酮○19甲醇清洗萃取小柱底部弃去○20加5ml甲醇，大试管B收集淋洗液○2132℃水浴，N2浓缩○29N2脱水干燥，不用水浴（如果3-4天内不上色谱检测则到此为止）○30用移液枪加2次100微升己烷于干燥样品中，摇动○31转入色谱仪专用的内衬管，2-3天内检测○322-3天-20℃保存，超过3天-80℃保存注意事项○1ａ．所有实验用品应为玻璃或氟塑料（PTFE,聚四氟乙烯），并且无脂。实验器材要用热水和无磷洗洁剂清洗。用流动水冲洗掉泡沫后再冲洗５次，再用去离子水冲洗10次，风干。使用前用化学纯（reagentgrade）氯仿冲洗；或在上述冲洗风干后在450℃下烘干4~5小时。严格地说实验器材应避免使用橡胶、软木塞以及除了聚四氟乙烯之外的塑料制品。如果受经费限制，使用的普通塑料制品应为一次性的，并且与有机溶剂的接触时间要尽可能的短。○1b．所用溶剂应为优级纯或者更高的等级。1）大部分实验者把将要使用的溶剂浓缩10~100倍后注入气相色谱仪，以观察溶剂是否有脂类污染。2）应谨慎的检查去离子水是否含有脂类；用有机溶剂（如正己烷，二氯甲烷）萃取50ml去离子水，浓缩萃取液，并注入色谱仪。3）重要的是，每批提取时应当作空白对照。这些空白样本除了不加入土样外所有操作都与其他样本相同。在以上三种情况下，气相色谱图没有波峰出现则说明没有脂类污染。实验所用的有机溶剂及其配制的溶液易受光热影响，应保存于棕色试剂瓶中。○2ａ．这一步所加的缓冲液的量每个样本都不同，缓冲液和土样中的水分相加后要使得最终提取液中各组分达到v（甲醇）：v（氯仿）：v（水）=2：1：0.8的理想体积比。（即水分总体积为5ml）这一体积比适用于总脂含量15mg及以下的土样。含有更多脂类的更大的样本，需要更多体积的提取液和不同的提取液配方。○2ｂ．有时，提取液在加入样品后会分为2相，这说明样品中含水量较大，可加入少量甲醇（1ml），震荡后静置。○2ｃ．光、热、氧气都会引起脂类降解，因此应尽量减少样品暴露于上述三个条件中的机会。○7-○11对大体积或低生物量的样品要进行二次提取。○14第14步结束后，如果无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N2保护下贮存于-20℃或-70℃下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或己烷，以进一步抑制氧化。○15使用前一定要用氯仿清洗硅胶柱。不同的成品硅胶柱的清洗和活化方式可能会有差异，具体方法参见产品说明书。再次强调，固相色谱柱一旦弄湿就决不能让它干掉。在分离过程中当停止液体流动时，最好保持柱子顶部有~100μl的溶剂。○16试管底部可加热至37℃以促进脂类融化。建议用手指托住试管底部体温加热，比较快捷可行。○17这一步可洗除柱中的中性脂。○18这一步洗除柱中的糖脂。有文献认为大量洗除需要40ml丙酮的用量。最好让丙酮全部流出来，掺几滴随后流出的甲醇也无妨。○21第21步结束后，如果无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N2保护下贮存于-20℃或-70℃下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或己烷，以进一步抑制氧化。○23每日制备新的甲基化氢氧化钾溶液。加入氢氧化钾这一反应产生FAME。○24在加入醋酸与加入己烷和水的过程中不能延迟。FAME很容易在水或者酸/碱基的存在下降解。加入己烷可以形成一个脂相，从而保护FAME不被水解。○26、○28宁可少收集一滴己烷也不能多流入一滴水相。总共有4ml己烷从反应试管中移入小瓶。○29碳链长度小于14的FAME无法用这种方法定量检测出来。如果要检测C13或碳链更短的脂肪酸的含量，溶剂应当吹干至“一滴”而不是全部吹干。这一步完成后如果无法立即进行接下来的步骤，获取的脂类样品可在N2保护下贮存于-20℃或-70℃下，加入1ml新鲜的二氯甲烷或己烷，以进一步抑制氧化。