分子克隆实验流程

分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µLddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µLddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。扩增体系：Reagent25µL50µL10xbuffer(含Mg2+)2.5µL5µLdNTP(10mM)0.5µL1µLrTaq酶0.25μL0.5μLprimer(10μM)1.25μL2.5μLTemplateDNA2μL4μLddH2O18.5µL37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloadingbuffer，上样5µL，1000bpmarker5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolutionI5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30-50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。4、42℃热激90S（时间不能太长，也不能太短）后静置于冰浴3min，加入750μL无抗生素的LB液体培养基，37℃200rpm恒温震荡培养1h。5、4000rpm离心2min，弃上清同时保留50μL混匀菌体沉淀后均匀涂布于抗性平板上。6、37℃恒温培养过夜。（16小时以上）LB（amp）抗性平板的制备配方：胰蛋白胨3g5g酵母提取物1.5g2.5g氯化钠3g5g琼脂4.5g7.5gddH2O300mL500mL121℃高压灭菌20min，降温加入氨苄（amp）抗生素（amp：LB=1:1000）六、摇菌实验前准备：生物安全柜紫外照射30min实验步骤：1、取出过夜培养的LB固体培养基平皿，观察是否有菌落长出。2、取3mlLB液体培养基于15ml管中，已经加入抗生素（氨苄），氨苄：LB培养基=1:1000（即：3μLamp+3mlLB）。3、在15ml管上做好标记，分别加入从LB培养基上挑取的单个菌落，37℃250rpm恒温震荡培养过夜（8小时以上）。七、菌液PCR（目的基因引物+载体引物）实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。反应体系：Reagent20µL10xbuffer(含Mg2+)2µLdNTP(10mM)0.25µLprimer(10μM)0.5μLTemplateDNA2μLrTaq酶0.25μLddH2O15µL反应程序：95℃预变性3min，（95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s）运行35个循环72℃后延伸7min，4℃保持九、测序PCR实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、（BD+5xbuffer）Mix提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。反应体系：Reagent10µL（BD+5xbuffer）Mix2.1µL模板DNA（纯化产物）3.5µLprimer(10μM)0.75μLddH2O3.65µL反应程序：96℃1min,(96℃10s,50℃10s,60℃3min)x304℃--十、质粒提取、菌种保存、浓度测定: