RNA剪接1

RNA拼接（RNAsplicing）：一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟RNA分子的过程拼接点：5’拼接点或左拼接点（内含子上游）3’拼接点或右拼接点（……下游）2、内含子的分类1982Davies等人中部核心结构（centralcorestructure）:在有些内含子中，含有4个重复的保守序列，长度为10~20bp，4个保守序列构成一种二级结构，在拼接中起重要作用由于并非所有的内含子都有中部核心结构，所以有了内含子的分类★Ⅰ类内含子（groupⅠ）:含有中部核心结构细胞器基因核基因★Ⅱ类内含子（groupⅡ）:不含有中部核心结构细胞器线粒体基因内核基因★Ⅲ类内含子（groupⅢ）:具有GU－AG特征的边界序列核基因mRNA前体★tRNA基因的内含子均位于tRNA的反密码环上四种内含子的边界序列各有一定共同的特征3、拼接方式方式一：由拼接装置完成（核mRNA内含子）可供识别的特异序列拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成方式二：自我拼接（两类内含子Ⅰ、Ⅱ）形成特定的二级结构RNA具有催化拼接的能力方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）前两种拼接都属于转酯反应二、tRNA的拼接（酵母为例）1、链的断裂和连接是两个独立的过程2、tRNA的内含子均位于反密码环的3’端，与反密码子相距一个Nt长14~16bp，其中含一段与反密码环互补的序列反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象酵母tRNAphe4、拼接过程研究方法构建温度敏感突变体（高温时……………..）分离累积tRNA前体体外加入野生型细胞抽提液研究拼接过程第一步：内切酶作用释放一条线状内含子分子和两个“tRNA半分子”两个tRNA半分子采取成熟tRNA分子的构象拼接过程第二步：RNA连接酶连接断端其中内切酶作用后产生5’OH和3’磷酸，3’磷酸端很快转变为2’，3’环式核苷酸因此，一个半分子有两个磷酸末端，一个半分子有两个－OH末端连接反应前要进行两个反应：a、左外显子的3’端成为OH（环式磷酸二酯酶）其3’位为OH，2’位为磷酸b、第二个外显子的5’端转变为磷酸基（多聚核苷酸激酶）因此Φ连接后还要切除第一个外显子的2’—磷酸这是tRNA内含子拼接重要特点之一前体RNA两个半分子进行两个连接反应成熟tRNA三、第Ⅰ类内含子的拼接特点：ø拼接属于自我拼接ø形成明显的二级结构1、结构特点：（1）5’拼接点和3’拼接点-------U↓……G↓↓↓5’……exon……U……intron……G……exon……3’（2）有由保守序列形成的二级结构a、保守序列为5’－P－Q－R－S－3’距拼接点很远，各10~12bpP与Q互补、R与S互补而形成中部核心结构b、二级结构中还包括内含子与外显子的某一序列互补所形成的二级结构内部引导序列（interalguidesequenceIGS）：内含子中能与两个拼接点边界序列配对的一段序列#第一类内含子的拼接依赖于以上二级结构－－为自我拼接的进行提供活性位点2、拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）（1）两种rRNA转录在一条35S的产物中，26SrRNA有内含子5’UG3’小rRNA大rRNA（26S有内含子）（2）35SRNA体外有自我拼接的能力反应需要：一价和二价离子鸟苷酸辅助因子（GTPGDPGMP和鸟嘌呤核苷）不需能量的供给（3）拼接反应后，G与内含子（414base）5’端以磷酸二酯键相连（放射性标记试验）（4）具体的拼接过程第一步：游离G发动的转酯反应G的3’-OH攻击内含子的5’拼接点G-内含子、左外显子（有游离3’OH）第二步：游离外显子（左）发动的转酯反应左外显子的3’-OH攻击3’拼接点，同时释放线状的内含子,形成成熟RNA分子☻两次转酯反应是紧密偶联的☻释放出的内含子可继续进行转酯反应而形成环状（5）自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内含子自身完成--------自我拼接的最大特点•转酯反应是将一处已有的磷酸二酯键变成另一处新的磷酸二酯键•内含子自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反应的构象和活性位点,在G的参与下完成拼接反应(内部引导序列)这一机制如下图所示:科罗拉多大学Cech等人完成（美）活性位点3、内含子的催化功能35SRNA前体拼接释放的内含子（414base）进行的自身转酯反应（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化A16（线性片段）U20(线性片段)逆环化逆环化（2）C—15:逆环化将UUU加到5’端的能力表明:该环形产物具有连接两个RNA分子的能力（3）L—19：具有酶活性即Cech等人证明的L—19的polyC聚合酶活性L—19分子L—19分子（4）总结：a、四膜虫的35SRNA的内含子有自身催化的性质即---将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷酸二酯键，不需要额外的能量因此：内含子可以看作是RNA重排酶（RNArearrangease）或RNA异构酶（RNAisomerase）其中：拼接反应中，“酶”和底物是同一个分子，且反应后变成了不同的分子b、L—19的polyC聚合酶活性进一步表明L—19具有酶的主要特征：专一性强加快反应速度反应前后酶分子保持不变人们称这种由RNA构成的酶为----核糖核酸质酶（ribozyme）可简称R酶四、第二类内含子的拼接1、拼接点序列7核苷酸的保守序列（BranchSite）3’拼接点上游6bp~12bp处●5’----exon-----GUGCG---------B.S----PyAU----exon---3’供点受点----PyPuPyPyUAPy---100%●在BranchSite的两侧存在一些短的序列，与其上游10-50Nt处互成IR,形成茎环结构(但A不包含在IR序列内,从而被排除成芽状突起）5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’IntronIRIR5’GAU3’A2、拼接机制（Splicingmechanism）IntronIRIRA5’GAU3’Exon1Exon2GAintronPyAUMaturalRNA“Lariat”intron套索状内含子转酯攻击位点intronOHAU2‘A3‘G五、核基因mRNA内含子的拼接1、相关概念Euk.的细胞中，有许多碱基数在100~300之间的小分子RNA,每个细胞有105~106个snRNA：细胞核中的（snRNP）scRNA：细胞质中的（scRNP）2、核mRNA内含子拼接的结构特点内含子拼接与其他加工同时进行拼接点序列Breathnach-Chambonrule（GU－AG规则）●5’---exon---GU--------intron--------AG------exon----3’供点100%94%受点●7Ntbranchsite3’拼接点的上游pyXpyUpuApy3、拼接机制（Splicingmehanism)●SnRNA(orScRNA)与拼接点序列间存在互补区域并参与剪接,形成拼接体(spliceosome)。●Spliceosome逐级组装，SnRNA（U1、U2、U5和U4／U6）分步替代●U1通过与5’拼接点互补而结合U2识别并结合分支点AU1和U2作用使内含子的5’端和3’端带到一起（U1与3’拼接点配对）U1、U2、mRNA与U4－U5－U6复合物形成一个完整的拼接体●第一次转酯－－左外显子、内含子剪切套索lariat●第二次转酯－－exons连接、套索状内含子释放●拼接体（spliceosome）解体与lariat降解同步名词解释转录启动子RNA拼接左、右拼接点不连续转录反式拼接转录终止子简答题1、说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。2、以E.coli为例，说出Prok.启动子结构及各部分功能。3、以Prok.为例简述转录起始过程。4、终止子和终止密码子有何区别？5、试述Prok.中转录终止子的类型及终止机制。6、解释E.coli的λ噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机制。7、简述内含子的种类及拼接方式8、说明tRNA内含子拼接的简单步骤和特点。9、tRNA基因的类型及各类型的前体在加工过程中所要解决的问题。10、说明poly(A)在分子生物学实验中的应用价值。11、为什么在细菌（Prok.）中很少涉及到ρ因子？12、Euk.mRNA帽子的种类。13、以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例，说明第Ⅰ类内含子拼接的简单过程及特点。