RNA剪接

1CHAPTER3RNASplicing•MolecularBiologyCourse鲁玉柱2Figure3-1Primarytranscript3真核生物绝大多数基因是嵌合体,包含内含子和外显子Exons(外显子):即编码序列Introns(内含子):外显子之间的非编码序列RNAsplicing（RNA剪接）:theprocessbywhichintronsareremovedfromthepre-mRNA.Alternativesplicing(可变剪接):一些pre-mRNAs可通过多种方式剪接,因而产生可变的mRNAs.60%的人类基因通过此种方式剪接.4Topic1:THECHEMISTRYOFRNASPLICINGCHAPTER13RNASplicing5RNA内部的序列决定了RNA剪接的位点ThechemistryofRNAsplicingpre-mRNA中内含子和外显子的边界具有特定核苷酸序列（specificnucleotidesequences）6Figure13-2Theconsensussequencesforhuman75’splicesite(5’剪接位点):靠近内含子5’端的exon-intron边界序列3’splicesite(3’剪接位点):靠近内含子3’端的exon-intron边界的末端序列Branchpointsite(分枝位点):一个“A”，靠近3’端内含子,其后是一段多聚嘧啶(Pytract).8内含子是以套马索的形式移除的，相邻的外显子连接起来需要两次连续的酯交换反应:步骤1:TheOHoftheconservedAatthebranchsiteattacksthephosphorylgroupoftheconservedGinthe5’splicesite.Asaresult,the5’exonisreleasedandthe5’-endoftheintronformsathree-wayjunctionstructure.ThechemistryofRNAsplicing9Figure13-3Three-wayjunction10Thestructureofthree-wayfunctionFigure13-411Step2:TheOHofthe5’exonattacksthephosphorylgroupatthe3’splicesite.Asaconsequence,the5’and3’exonsarejoinedandtheintronisliberatedintheshapeofalariat.12Figure13-313ExonsfromdifferentRNAmoleculescanbefusedbyTrans-splicingTrans-splicing（反式剪接）:不同RNA中的两个外显子可以通过RNA剪接连接起来.ThechemistryofRNAsplicing14Trans-splicingFigure13-5Notalariat15Topic2THESPLICESOMEMACHINERYCHAPTER13RNASplicing16剪接体（spliceosome）：进行hnRNA剪接时形成的多组分复合物,主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。pre-mRNA中内含子的剪接是由spliceosome介导完成.spliceosome包含大约150种蛋白质和5snRNAs(?).Spliceosome的许多功能的完成是由其RNA成分决定.Thespliceosomemachinery17snRNA(smallnuclearRNAs)包括5种(U1,U2,U4,U5,andU6,100-300nt).ThecomplexesofsnRNA和蛋白质复合体被称为smallnuclearribonuclearproteins(snRNP,pronounces“snurps”).剪接体是最大的snRNP,在剪接反应的不同阶段其组分是不同的18snRNPs在剪接中的三个功能1.识别5’端剪接位点和分支位点.2.连接这两个位点.3.催化(orhelpingtocatalyze)RNA切割.在剪接过程中RNA-RNA,RNA-protein和protein-protein相互作用是非常重要的.19Figure13-6不同snRNPs之间,snRNPs和pre-mRNA的RNA-RNA相互作用20Topic3SPLICINGPATHWAYSCHAPTER13RNASplicing21剪接体的装配、重排和催化：剪接的途径(Fig.13-8)装配步骤11.U1识别5’剪接位点.2.U2AF的一个亚基与（多聚嘧啶）Pytract结合，另外一个与3’剪接位点结合.前者还与BBP相互作用以让BBP结合到分支位点.3.这样早期复合体组装完成Splicingpathways22装配步骤21.U2结合到分支位点,这样A复合体组装完成.2.Thebase-pairingbetweentheU2与分支位点的互补结合特点导致分支位点的A突出(Figure13-6).该突出的A就可以利用来与5’剪接位点作用.23Figure13-8EcomplexAcomplexFigure13-6b24装配步骤31.U4,U5和U6组装成一个3－snRNP颗粒（tri-snRNPParticle）.2.随后，A复合体便转化为Bcomplex.25Figure13-8AcomplexBcomplex26组装步骤4U1被U6替代后并离开5’剪接位点.U4从复合体中释放,从而允许U6与U2相互作用(Figure13-6c).这次重排后的就形成了C复合体（Ccomplex）.27Figure13-8Figure13-6cBcomplexCcomplexinwhichthecatalysishasnotoccurredyet28催化步骤1:Ccomplex形成后便会产生一个活性部位（activesite）,通过U2和U6RNAs的作用形成的该活性部位允许pre-mRNA的5’剪接位点和分支位点共存,从而使得分支位点A可以攻击5’剪接位点，完成第一次酯交换反应.29催化步骤2:U5snRNP使两个外显子在一起,并促使第二次酯交换反应进行,该反应中5’外显子的3’-OH攻击3’剪接位点.末步骤:释放mRNA和snRNPs30Figure13-8Ccomplex31EcomplexAcomplexBcomplexCcomplex（没有该complex的图）splicesome-mediatedsplicingreactionsFigure13-832Self-splicingintronsrevealthatRNAcancatalyzeRNAsplicing自剪接内含子（Self-splicingintrons）:即在RNA的前体中，内含子自身可以折叠成一个特有的结构（aspecificconformation），从而催化自身释放并将外显子连接起来揭示了RNA可以催化RNA的剪接Splicingpathways33Adamsetal.,Nature2004,Crystalstructureofaself-splicinggroupIintronwithbothexons34如何鉴定一个RNA自剪接的内含子:在试管中，不加任何蛋白质和其它RNA的情况下，内含子依然可以将自身从RNA前体中移除.两种类型的自剪接的内含子：groupI和groupIIself-splicingintrons.35TABLE13-1ThreeclassofRNASplicingClass丰度机制催化方式Nuclearpre-mRNA多数真核基因两次酯交换反应;分支位点AMajorspliceosomeGroupIIintrons少；真核细胞器基因和原核基因和pre-mRNA的机制一样同上RNAenzymeencodedbyintron(ribozyme)GroupIintrons少;真核细胞的核rRNA；细胞器基因；和少数原核基因两次酯交换反应;需外源的GSameasgroupIIintrons36groupII内含子的剪接机制与pre-mRNA的方式相似37Figure13-938GroupI释放的是一个线状的而不是一个套马索式的内含子groupI内含子用的是游离的G而不是用分支位点A去攻击5’剪接位点.这个G附着在内含子的5’末端.5’端外显子的3’-OH然后攻击3’剪接位点.通过两次酯交换反应（如同groupIIintron和pre-mRNAintrons一样）将外显子连接起来.Splicingpathways39GinsteadofAalinearintronaLariatintronFigure13-9401.比groupIIintrons小2.其二级结构保守,且包含一个内在的引导序列，该序列和5’剪接位点中外显子部分序列互补配对.3.其三维结构形成一个口袋，可以容纳GGroupI内含子41在第一次酯交换过程中，groupIIintrons和U2-U6snRNA复合体形在结构上的某些相似性Figure13-1042剪接体如何寻找剪接位点Splicingpathways剪接位点识别错误的两种情况：剪接位点被遗漏.假的剪接位点被错误的识别,尤其是3’剪接位点.43Figure13-1244剪接位点识别错误的原因(1)外显子的平均长度是150nt,而内含子的平均长度是3,000ntlong(一些甚至达到了800,000nt)Itisquitechallengingforthespliceosometoidentifytheexonswithinavastoceanoftheintronicsequences.45(2)与剪接位点特异性不高有关系sequenceareratherloose.Forexample,onlyAGGtri-nucleotidesisrequiredforthe3’splicesite,andthisconsensussequenceoccursevery64nttheoretically.461.因为RNApolymeraseII的C-terminaltail负载着很多剪接蛋白质,因而从RNAPII中刚出来的新合成的RNA的剪接位点被容易识别，从而避免了剪接位点被遗漏的现象两种提高识别剪接位点的精确度的方法472.还有一个优先识别靠近外显子的剪接位点的机制：SRproteins结合ESEs(exonicsplicingenhancers)并位于外显子区域，它们的存在提高了利用附近剪接位点进行剪接的效率48SRproteins,boundtoexonicsplicingenhancers(ESEs),interactwithcomponentsofsplicingmachinery,recruitingthemtothenearbysplicesites.Figure13-13491.提高剪接精确度和剪接效率2.调节可变剪接3.SRproteins的种类很多.其表达具有组织特异性因而决定着可变剪接的组织特异性SRproteins对于RNA剪接是必要的50Topic4ALTERNATIVESPLICINGCHAPTER13RNASplicing51高等真核生物的许多基因用过可变剪接产生两种或者更多的mRNA，因而产生不同的蛋白质.通过可变剪接，单基因可有不同的表达产物Alternativesplicing52DrosophilaDSCAMgenecanbesplicedin38,000alternativewaysFigure13-1353Figure13-15Therearefivedifferentwaystoalternativelyspliceapre-mRNA54可变剪接既可是组成型的，又可是调节型的Constitutivealternat