第八章-RNA转录后的剪接与加工

RNA的转录复习•原核生物与真核生转录的异同点？第八章RNA转录后的剪接与加工讲授：陈友琼州学院生物科学与技术学院[e-mail]几个概念1、断裂基因、内含子和外显子2、hnRNA、sRNA真核生物的结构基因，由若个编码区和非编码区互相间隔开所形成的基因真核生物的结构基因上，能够编码特定的蛋白质的DNA序列真核生物的结构基因上，不能编码特定的蛋白质的DNA序列核内不均一核RNAmRNA的原初转录产物在核内形成的大小不等的中间物，相对分子质量很大，也很不均一，我们将其称为核内不均一RNA。hnRNA、(heterogeneousnuclearRNA)sRNA(100-300base,0-106/cell):？1）scRNA:细胞质中小分子RNA称细胞质小RNA(smallcytoplasmicRNA)。2）snoRNA:在核仁中存在的一类小的RNA，称为核仁小RNA(smallnucleolarRNA)。3）snRNA:细胞核中的小分子RNA称细胞核小RNA(smallnuclearRNA)。与核内的蛋白质构成核小核糖核酸蛋白体(snRNP)，在内含子上装配成剪接体(splicesome)，参与mRNA的剪接。rRNA和tRNA有以下三点特性：1）所有RNA初级转录产物的5`末端均是5`-三磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子的5`末端是5`单磷酸；2）rRNA和tRNA分子比初级转录产物小很多；3）所有tRNA含有稀有碱基。tRNA和rRNA被加工的证据8.1原核生物RNA的转录后加工E.coli7个rRNA转录单位分散在基因组中；转录单位由16S、23S、5SrRNA以及tRNA基因组成，rrnA~rrnG.8.1.1原核生物rRNA前体的加工tRNAIletRNAAlatRNAAsptRNATrp16S23S5SRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRRNaseR图13-rRNA的加工rRNA的加工8.1.2原核生物tRNA的加工tRNA前体的存在方式：1.不同的tRNA串联排列；2.多个相同的tRNA串联排列；3.tRNA与rRNA混合串联排列。修饰过程：1.由RNA核酸内切酶在tRNA分子5`端切断；RNaseP2.由RNA核酸内切酶在tRNA分子3`端切断；RNaseF3.tRNA分子3`端添加-CCAOH；RNaseD4.核苷酸的修饰与异构化原核生物tRNA前体分子的加工a、切除tRNA前体两端多余的序列：5’—端切除几到10个核苷酸。b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修饰：形成稀有碱基如DH2。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸内切酶的作用表示核苷酸转移酶的作用表示核酸外切酶的作用表示异构化酶的作用8.1.3原核生物mRNA的加工P早期转录基因A1A2A30.30.711.11.21.3tRNaseⅢpppPuCoHpppPu前导序列0.30.711.1/1.21.3mRNA图13-T7噬菌体早期区转录单条前体RNA，经RNaseⅢ剪切成5条成熟的mRNA1E．coli90’/100’处rplJ(L10)rplJ(L10)rpoB(β亚基)rpoC(β’亚基)转录前体多顺反子mRNARNaseⅢ加工成熟的mRNA8.2真核生物RNA的加工剪接加工是RNA分子转录后水平的基因表达调控方式之一。tRNA、rRNA：切除间隔序列，内含子剪接，5`和3`端的修饰以及碱基的修饰等。8.2真核生物RNA的加工mRNA：非常复杂，需要snRNA的参与，与蛋白质因子构成核糖核蛋白体(snRNP)。在剪接过程中形成的剪接复合物称为剪接体,剪接体的主要组成是蛋白质和小分子的核RNA(snRNA)。复合物的沉降系数约为50～60S,它是在剪接过程的各个阶段随着snRNA的加入而形成的。也就是说在完整的pre-mRNA上形成的一个剪接中间体。剪接体的装配同核糖体的装配相似。依靠RNA-RNA、RNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质等三方面的相互作用。比核糖体更复杂，要涉及snRNA的碱基配对，相互识别等。8.2.1tRNA的转录后加工•主要有以下几种加工方式：1.切断：“斩头”，形成5′末端；去尾，形成3′-OH末端。。2.剪接。3.3’-末端-CCA序列添加：缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。4.化学修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)。真核tRNA的基因和原核不同：？(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)tRNA的前体分子中含有内含子。真核tRNA内含子的特点：①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；③外显子和内含子交界处无保守序列；④内含子的剪切是依靠RNase异体催化；⑤内含子和反密码子配对形成茎环。tRNA前体RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNAtRNA前体的转录合成tRNA前体的切断和剪接加工13’3’3’3’5’核酸酶5’折叠5’连接5’OH5’3’OH5’OH2’－3’P2’－3’PtRNA链O碱基O碱基OHPCH2O碱基CH2O碱基OOOHOPOPOOHOHOOOtRNA链tRNA链2’－3’环磷酸3’－OH,2’磷酸环磷酸二酯酶打开2′-3′环磷酸激酶使5′-OH磷酸化tRNA3'-末端-CCA序列的添加tRNA的碱基修饰（2）还原反应如：UDHU（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：AI如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）rRNA的结构(1)切除5′端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。8.2.2真核细胞中rRNA的加工1剪切位点5’3’18S5.8S28S人类HeLa细胞途径：小鼠L细胞途径：45S41S41S32S36S20S18S18S32S28S－5.8S28S－5.8S8.2.3剪接方式的分类内含子的剪接分三类：1、自我剪接的内含子：I型和II型2、蛋白质(酶)参与的内含子主要存在于tRNA中3、依赖于snRNP的内含子真核细胞核的蛋白质8.2.4真核mRNA的转录后加工基因hnRNA首、尾修饰hnRNA剪接、编辑成熟的mRNA一、hnRNA(一)核内不均一RNA(heterogenousnuclearRNA,hnRNA)平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度(1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5′端都有帽子结构，表明二者为相同的聚合酶所合成；(4)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。hnRNA的结构的特点(1)5′端有帽结构；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；(4)有重复序列，位于寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。二．5′端帽子结构1．加帽（addingcap）：帽子结构:(m7GpppGp—)7-甲基鸟苷三磷酸它由甲基化鸟苷酸经焦磷酸与mRNA的5‘末端核苷酸相连，形成5’,5‘-三磷酸连接(5’,5‘-triphosphatelinkage)。mRNA5’端的这种结构称为帽子（cap）。即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。加工过程首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。m7Gppp鸟苷酸转移酶7-甲基鸟嘌呤-三磷酸鸟苷5’-5’磷酸二酯键。Pi5ppGp…磷酸酶5pppGp…5GpppGp…pppGppi鸟苷酸转移酶5m7GpppGp…甲基转移酶SAM帽子结构的生成(1)剪接前加帽如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒和口炎病毒真核生物剪切前加帽的生化反应过程GN1N2N3磷酸水解酶PPPPPPP…PPPPPP…＋PiGmRNA鸟苷脱酰转移酶PPPPPP…PPPOH加帽酶SAMOHPPPPPPP(S-腺苷甲硫氨酸)OHPPPPPPP＋＋PPi……GN1N2N3GN1N2N3GGN1N2N37mGmGmN1N2N3PPPPPPPP…PPPPPPPOH＋PPPPPPPPPPPSAMPPPPPPPPPPPPPPGN1N2N3GN1N2N3GN1N2N3GN1N2N37mGN1N2N3………………＋PiN1N2N3真核生物剪切后加帽的生化反应过程2、帽子的类型•在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子（capO）；•在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap1)；•此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。•这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructure）。HN—CH3m7G帽子0mRNA5端的帽子位置和可被甲基化的位点3、帽子结构的功能1.有助于mRNA越过核膜;2.保护5′不被酶降解；3.使mRNA能与核糖体小亚基结合；4.被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质合成;5.帽子结构对mRNA前体的剪接是必需的.(1)识别AAUAAA并指导其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；(3)末端腺苷转移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP(polyadenylatebindingprotein)与poly(A)结合，反应停止。三、3’-末端PolyA尾:（长约100-200bp）生成：在核内修饰,与转录终止同时进行.作用：增加mRNA稳定性，维持翻译模板活性。转录起始延伸5’帽子AAUAAA剪切Poly(A)聚合酶5’帽子AAUAAAAn图13-mRNA3’端加Poly(A)尾巴加Poly(A)的反应第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。加上～200A后反应停止复合体解离5’3’CPSFCFⅡAAUAAACstFCFⅠPAP5’3’CPSFCFⅡAAUAAA3’CstF5’CFⅠPAPCPSFAAUAAAAAAAAA3’CstFPAPPBPCPSFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’CstFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’图13-3’端加尾反应和相关的蛋白质因子CPSF：specificitycomponentCstF：剪切活化因子CF：cleavagefactorsPBP：Poly(A)结合蛋白(GENESVIFig.30.28)各种3’加工成分组装成复合体剪切因子(CF)产生3’端3’末端Poly(A)聚合酶(PAP)加APBP与Poly(A)结合Ⅰ类内含子中含有的共同的二级结构外显子1G-OH第一次转移5’CUCUCUA3'3'GGGAGGPG-OHIGSP55'UGCGGG3'3'ACGCCC5'P1P2P4QP3P6外显子1P8G外显子2P72bpSP95'UAG