细胞培养基本技术

细胞培养基本技术BinLuAttardiInstituteofMitochondrialBiomedicine主要内容一、细胞培养的基本概念二、细胞培养的基本条件三、细胞培养用液的配制四、细胞培养的基本方法五、培养细胞活力测定六、细胞冻存和复苏七、细胞培养的污染和检测是指从体内取出组织，分离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。一、细胞培养的基本概念细胞培养(cellculture)：把活体的一小片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。组织培养(Tissueculture)：器官培养(Organculture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于生长并同时保持其一定的结构和功能特征。细胞培养的基本概念原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。优点组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。传代原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。传代注意事项•接种数量为5×10～8×10个/ml。•传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。•培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。•如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。45原代培养细胞的生命归宿1.原代培养期2.传代期3.衰退期细胞系（cellline）：传代培养的细胞是细胞系(原代培养物经首次传代成功后即成细胞系)。有限细胞系（finitecellline)，无限细胞系(infinitecellline)细胞系（cellline）肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，具有不死性和异体接种致瘤性。细胞株（cellstrain）由具有某些特性与标志的细胞，经选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在后续的培养中一直保持下去的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。细胞系或细胞株的命名以供体患者的姓名命名：HeLa（来源于宫颈癌）以时间地点来命名：CHO中国仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立，每3天传代，每次接种3×105细胞／ml以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞)以临床疾病类型命名：如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)二、细胞培养的基本条件无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存条件实验室安全细胞培养的无菌环境无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。（使用前）紫外照射（15-30分钟）每周甲醛熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面一次的方式进行消毒超净工作台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。超净工作台的使用使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟；预工作10－15分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态。使用完毕后要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。火焰消毒在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管常用培养器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗一般经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50℃烘干。新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。*清洁液的配制消毒压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。消毒前常用的包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒电热干燥箱：干热消毒，160℃～180℃，维持2小时。主要用于玻璃器皿消毒。细胞培养的实验用品细胞培养瓶(Flask)25平方厘米（T25)75平方厘米(T75)150平方厘米(T150)细胞培养板(Plate)6孔12孔24孔48孔96孔细胞培养皿(Dish)35mm60mm100mm150mm冻存管CryoVial1.2ml2ml5ml离心管15ml50ml细胞刮滤器大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒。③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。培养细胞的观察液氮罐何处购买细胞ATCC细胞库().美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心。目前它可以提供以下物品细胞系3000种细菌和噬菌体15000种动植物病毒2500种原生动物1200种以及重组物品欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)国内细胞库中国科学院细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心中国典型培养物保藏中心也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料／菌种保藏机构。培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒细胞的营养碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素细胞培养的常用液体水平衡盐溶液pH调节液消化液抗生素溶液培养基三、细胞培养用液的配制水：新鲜的三蒸水或去离子水平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度常用的缓冲液：生理盐水PBSHanks液（D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000mlD-Hank’s液pH调节液碳酸氢钠液HEPES缓冲液是一种氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定的pH范围。通常使用浓度为10～15mM，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。消化液胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液胰蛋白酶溶液主要作用：水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。常用浓度：0.25%用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。EDTA溶液作用机制：通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子，从而破坏细胞间的连接。使用浓度：0.02%，配制时应加碱助溶。EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。胶原酶溶液主要作用水解结缔组织中胶原蛋白成分，而对上皮细胞影响不大。常用剂量：最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%，可用D-hanks、PBS或含血清的培养液配制。分型：分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型（价格贵）。胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项目胰蛋白酶胶原酶消化特性消化软组织消化纤维多的组织用量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL（200U/mL）消化时间0.5~2h1~12hpH8~96.5~7.0作用强度强烈缓和细胞影响时间过长有影响无大影响血清抑活有无Ca2+和Mg2+有影响无影响抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。配制具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、M199、MEM另有无血清培养基、无蛋白培养基人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。RPMI1640最初是由G.E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其组分较为简单，适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。RPMI1640种类RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高压灭菌）RPMI—1640（含谷氨酰胺、过滤灭菌）DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（4500g/L）和低糖型(1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞等。DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】血清的使用血清质量好坏是实验成败的关键常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。优质血清的标准透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）56℃，30分钟。血清的消毒：过滤除菌牛血清胎牛血清应取自剖腹产的胎牛新生牛血清取自出生24小时之内的新生牛小牛血清取自出生10～30天的小牛使用浓度：一般为5～20％，最常用是10％。何谓FBS、FCS、CS、HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calfserum)是指小牛血清HS(horseserum)是指马血清血清解冻步骤逐步解冻法–30℃或–80℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用50ml无菌离心管可分装40～45ml。勿直接由–30℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。无机盐CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。谷氨酰胺细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。配制方法：谷氨酰胺2.9