大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化

8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lacoperator，T5/lacoperator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。HisTag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+Fe2+Zn2+Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GEHealthcare（原Amersham）提供。8.1.2宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliDH10B，E.coliNovaBlμe等recA–和endA–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：BL2：lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。BL21（DE3）：DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌。IPTG诱导的lacΜV5启动子控制T7RNA聚合酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta™系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-CodonPlus系列：包括BL21-CodonPlus®（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs®-RIL，BL21-CodonPlμs®（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs®-RP，BL21-CodonPlus®（DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。M15/SG13009：自身表达T5RNApolymerase，主要用于pQE系列载体的表达。另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表1大肠杆菌密码子使用频率统计TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFRQTTTTF19.7TCTS5.7TATY16.8TGTC5.9TTCF15TCCS5.5TACY14.6TGCC8TTAL15.2TCAS7.8TAAstop1.8TGAstop1TTGL11.9TCGS8TAGstop0TGGW10.7CCTTL12CCTP8.4CATH15.8CGTR21.1CTCL11CCCP6.4CACH13.1CGCR26CTAL5.3CCAP6.6CAAQ12.1CGAR4.3CTGL46.9CCGP26.7CAGQ27.7CGGR4.1AATTI30.5ACTT8AATN21.9AGTS7.2ATCI30.6ACCT22.8AACN24.4AGCS16.6ATAI30.7ACAT6.4AAAK33.2AGAR1.4ATGM30.8ACGT11.5AAGK12.1AGGR1.6GGTTV16.8GCTA10.7GATD37.9GGTG21.3GTCV16.9GCCA31.6GACD20.5GGCG33.4GTAV16.1GCAA21.1GAAE43.7GGAG9.2GTGV16.11GCGA38.5GAGE18.4GGGG8.68.2表达条件的建立为了方便后续的纯化操作,保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚,但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。8.2.1确定表达状况转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200rpm继续诱导培养，可以在2h，4h，6h分别取样以分析表达状况。将取出的1ml菌液12000rpm离心1min，收集菌体，加入1mlPBS缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。再加入300～500mlPBS重悬细胞。超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）将破碎液体4℃，12000rpm离心10min，分离上清和沉淀。SDS-PAGE分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。若目标蛋白的表达主要分布于沉淀，则可以尝试一下几种方法来改善表达。改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP,TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxinredμctase/glμtathioneredμctase双突变适合带thioredoxinredμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。8.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。可以用来检测蛋白的表达情况(表达量，表达分布等)，用来分析纯化的目的蛋白的纯度。本小节列出SDS-PAGE操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。8.2.2.1主要试剂的配置（1）30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS-PAGE的相关实验。（2）1.5mol/LTris（pH8.8）溶液。（3）10%SDS溶液：SDS10.0g加入ddH2OToTo100。（4）10%过硫酸铵：新鲜配制。（5）TEMED溶液：4℃保存。（6）1.0mol/LTris（pH6.8）溶液。（7）2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液。（8）5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：15.1gTris，94g甘氨酸和5gSDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。（9）考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。（10）脱色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。8.2.2.2主要操作步骤1、凝胶制备（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。（3）在分离胶聚合的过程（可置于37℃，约10min）中，配制5%的积层胶（参考表格3）。（4）分离胶聚合完全后，倒去异丙醇或水，用滤纸吸干胶面上的残余。（5）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。（6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，拨去封胶用的塑料条，固定于电泳槽。（7）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。2、样品的制备在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，混合液在沸水浴中加热5min，冷却后即可上样。3、上样用微量移液器上样，每加入一种样品，上样量根据根据具体的样品浓度确定，未知浓度一般用10微升。4、电泳对于一块胶，在浓缩胶中电流设置在15～20mA,当染料进入分离胶后可设置电压至电流约为25～30mA，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。5、后处理（1）染色：加入染色液（用量同上），室温染色30min～1h。Tip：染色前可将染色液在微波炉里加热至沸，然后摇床震荡染色约10min即可。（2）脱色：将染色后的胶块用水洗涤三次去除表面染料，然后加入脱色液脱色，其间更换脱色液3～4次至条带清晰。Tip：10min快速脱色:将脱色液置于微波炉煮沸，更换三次脱色液。表2.配制SDS-PAGE不同浓度分离胶的配置不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）Gel%组成所需要各成份体积（ml）510152025306%水2.65.37.910.613.215.930%丙烯酰胺溶液1234561.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.856.37.510%SDS0.050.10.150.20.250.310