病毒学检验重点

病毒的特点：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染体外细胞培养的基本条件：1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、4、培养液营养成分、5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、6、气体条件（细胞生长需要CO2，大规模培养需要有足够的氧气）、7、温度（最适温度为35-37。C）、8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、9、无菌条件等实验动物的微生物控制分类：普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病菌的感染无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体实验动物的遗传学分类近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物大鼠、小鼠的采血方法剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血0.1ml，大鼠约0.4ml眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧，使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。颈（股）动脉或颈（股）静脉采血，麻醉动物，剪去被毛，作颈静脉或劲动脉分离术后采血摘眼球采血，采血时，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球凸出，右手用弯头镊子摘除眼球，迅速采集血液病毒的纯化方法：一般原则释放病毒至细胞外、去除细胞碎块、病毒悬液浓缩PEG浓缩法，包括直接加入法、液体浓缩法、固体浓缩法超过滤法吸附法，有凝胶吸附法、红细胞吸附法超速离心法中和试验及其应用是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度1、鉴定病毒、2、分析病毒抗原的性质、3、测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果、4、测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病鸡胚培养的优缺点优点组织分化程度低，病毒易于繁殖来源充足，其本身很少携带病毒和细菌，敏感范围广，对接种的病毒不产生抗体有神经血管的分布和脏器的构造缺点与除引起鸡胚死亡的病毒及产生痘疱的病毒外，通常不产生特异性的感染指症，必须通过另外的实验来证明病毒的存在鸡食入的抗生素会使某些病原体的繁殖收到抑制某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚PCR（聚合酶链反应）基本反应体系和步骤反应体系：需要扩增的模板、与DNA靶序列3’末端互补的合成引物、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶、合适的缓冲液体系。基本步骤与反应：变性，将反应体系混合物加热至94⁰C，维持约30~60秒，使待测双链DNA变性解链为单链模板。2、退火，冷却至特定的温度（引物的Tm值左右，一般为45~65⁰C），一对寡糖核苷酸引物分别与正、负单链DNA序列两端互补结合。3、延伸，将温度提高至72⁰C并维持一段时间，引物在聚合酶作用下，以3´端为起点，4种dNTP为原料，按碱基配对原则，沿5´→3´方向延伸，合成两条新DNA链。基因克隆以及基本步骤：利用酶将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割、重组连接、组成新的DNA重组子，导入宿主细胞，随着宿主细胞的繁殖从而得到大量自带DNA重组子或其表达产物。基本步骤：1、分离或合成目的基因2、将目的基因在体外插入载体形成重组DNA3、将重组DNA导入宿主细胞4、重组体的筛选、鉴定和分析乙肝病人血清学检测的五项指标：HBsAg（表面抗原）、抗-HBs（表面抗体）、抗-HBc（核心抗体）、HBeAg（e抗原）、抗-HBe（e抗体）乙肝病毒血清学检查三种主要抗体及其意义1、抗-HBe一般存在于无症状HBV携带者及活动期慢性肝炎患者中。2、抗-HBs：是HBsAg刺激机体产生的特异性中和抗体，是保护性抗体。阳性表明机体已经产生免疫力3、抗-HBc：包括抗-HBcIgM、抗-HbcIgG，前者是急性感染的重要指标，也是慢性活动肝炎的重要标志。阳性主要见于乙肝恢复期，慢性感染和既往感染。空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度。凡是能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量血凝试验（HA）：有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，这就是所谓的红细胞凝集现象。当病毒数与红细胞数比值足够大时，病毒会与红细胞结合成网状，造成悬浮液沉淀或凝集血凝滴度HT：将红细胞与一系列病毒稀释液混合。造成凝血的最高稀释倍数即为血凝滴度电镜分辨率：是指分清楚两个点或两条线中心之间的最小距离的能力负染色技术：高密度物质如重金属磷钨酸、醋酸铀等在透射电镜下形成黑色的背景反衬低密度的标本，从而清楚的显示出被衬物的细节结构质粒：是存在于细菌染色体之外的、可自主复制的双链环状DNA，几乎完全裸露，易于分离纯化。核酸杂交技术：用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性结合，形成杂交体，并体用相应的显示技术检测目标核酸的存在及其位置。Southern印迹杂交：一是将待测定核酸DNA分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。步骤包括：1、待测核酸样品的制备与限制酶消化2、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品3、电泳凝胶的预处理4、转膜5、探针标记6、预杂交与southern杂交7、洗膜8、放射性自显影检测。Nouthern印迹杂交：将RNA样品通过琼脂凝胶电泳进行分离，再转移到固相支持物上，用探针对其进行杂交，将具有阳性的位置与标准相对分子质量进行比较可得到RNA种类的数目、分子大小及丰度等信息。Ct值：值每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。核酸探针：是指以研究和诊断为目的，带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，用来检测特定序列核酸的DNA或RNA片段。Tm值：Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)CPE细胞病变效应：是病毒或接种分离标本后。细胞出现的病理性变化。不同的病毒可引起不同的细胞病变效应。干扰现象interferencephenomenon：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在细胞内的增值。复性：变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的链又可重新结合成为双螺旋结构，这个过程称为复性。方法是缓慢冷却。