蛋白质工程

浅谈蛋白质工程摘要：在论述蛋白质工程基本概念、由来和目标的基础之上，介绍了蛋白质工程的主要研究内容，并着重介绍了蛋白质工程在医药、农业、工业等方面的研究进展，最后还介绍了蛋白质工程的发展前景。关键词：蛋白质工程研究内容研究进展蛋白质工程应用Introductiontoproteinengineering(northeastagriculturalcollegeofresourcesandenvironment,Harbin150010).Abstract:inproteinengineeringisdiscussedonthebasisofthebasicconcept,originandtarget,thispaperintroducesthemainresearchcontentsoftheproteinengineering,proteinengineeringinmedicine,andemphaticallyintroducestheresearchprogressofagriculture,industry,etc,andthedevelopingprospectsofproteinengineeringisintroducedinthepaper.Keywords:proteinengineeringresearchcontentengineeringapplicationresearchprogressofprotein1蛋白质工程的由来和目标蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发这就是蛋白质工程的由来。它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。这种新型蛋白质必须是更符合人类的需要。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。2.蛋白质工程研究的核心内容2.1蛋白质结构分析蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有的生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质(几毫克~几十毫克)。制备出晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。对子哪些很微量的蛋白质来说，是比较困难的。另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同。在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的肤链结构,这种方法绕过了结晶、X一射线衍射成像分析等难点,直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维,在计算机的辅助下,可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲,核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况,以开发具有高度专一性的药用蛋白质。2.2蛋白质结构、功能的设计和预测根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据,可以预测一定氨基酸序列肤链空间结构和生物功能;反之也可以根据特定的生物功能,设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系;也可以通过分子动力学、分子热力学等,根据能量最低、同一位置不能同时存在的两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。目前,正加紧这方面的工作。虽然尚在起步阶段,但在可预见的将来,建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系,用以设计、预测蛋白质的结构和功能。2.3蛋白质的创造和改造蛋白质的改造,从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法:对蛋白质进行变性、复性处理,修饰蛋白质链官能团,分割肤链,改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等;生物化学法:使用蛋白酶选择性地分割蛋白质,利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团,利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用.缺乏特异性,不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成DNA,不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构,它决定着蛋白质空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的,改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列,实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前,宜采用随机诱变,造成碱基对的缺失、插入或替代,这样就可以将研究目标限定在一定的区域内,从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后,就可以运用定位突变等技术来进行研究。2.3.1定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的,只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸,研究蛋白质结构、稳定性和催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段,在噬菌体粒子中其基因组为单链,侵入宿主细胞以后,通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M13,制得单链模板,人工合成一段寡核苷酸(其中含一个或几个非配对碱基)作为引物,合成相应的互补链,用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌,双链分子的胞内分别复制,因此就得到两种类型的噬菌斑,含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。2.3.2盒式突变1985年wels提出的一种基因修饰技术——盒式突变,一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体,可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点,用该内切酶消化基因,再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。2.3.3PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的DNA基因扩增技术,以研究基因为模板。用人工合成的寡核苷酸(含有一个或几个非互补的碱基)为引物，直接进行基因扩增反应,就会产生突变型基因。分离出突变型基因后,在合适的表达系统中合成突变型蛋白质,这种方法直接、快速和高效。2.3.4高突变率技术从大量的野生型背景中筛选出突变型是一项耗时、费力的工作。有两种新的突变方法具有较高的突变率,(1)硫代负链法:核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物(a一(S)-dCTP)对某些内切酶有耐性,在有引物和(a一(S)-dCTP)存在下合成负链,然后用内切酶处理,结果仅在正链上产生“缺口”,用核苷酸外切酶3从3~5`扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸,在聚合酶作用下修复正链,就可以得到二条链均为突变型的基因;(2)UMP正链法:大肠肝菌突变株RZ1032中缺少尿嘧啶糖苷酸和UTP酶,M13在这种宿主中可以用尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠肝菌,结果含U的正链被寄主降解,而突变型负链保留并复制。2.3.5蛋白质融合将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起.经基因克隆和表达,产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上,显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等,就是采用的这种方法。3.蛋白质工程应用研究进展当前，蛋白质工程修饰、改造的蛋白质为数不算多，但进展较快。随着基因组测序的国际联合行动的快速进展，也带来并已出现了蛋白质高速发展的新阶段。3.1在医药方面许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。如人的β-干扰素和白细胞-2是两种抗癌作用的蛋白质。但在它们的分子结构中，有一个不成对的基因，是游离的，因而很不稳定，会使蛋白质失去活性。当通过蛋白质工程修饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性。美国的Cetus公司成功地修饰了这两种治疗癌瘤的蛋白质，大大提高了它们的稳定性，已用于临床试验并取得了良好的效果。具有抗癌作用的蛋白质工程产品免疫球蛋白质是一种高效治癌药物，它能成为征服癌症的“生物导弹”，即具有对准目标杀死特定癌细胞而不伤害正常细胞的特效。近年来，澳大利亚医学科学研究所的一个微生物研究课题组经过多年的研究后发现了激发基因开始或停止产生癌细胞的蛋白质。这种蛋白质在癌细胞生长过程中对癌基因起着开通或关闭的作用。这个发现，对于通过蛋白质工程研制鉴别与控制多种类型的血液癌、固体癌的蛋白质有很好的作用，并为诊断和治疗癌症提供了新的方法。目前，应用蛋白质工程研究开发抗癌及抗艾滋病等重大疑难病症等方面，均取得了重大进展。另据实验，蛋白质工程还可以改变α1抗胰蛋白（ATT）。运用此工程技术在ATT的Met358和Ser359之间切开后，可以与嗜中性白细胞弹性蛋白酶迅速结合而引发抑制作用。在病理学的氧化条件下可导致Met358变成蛋氨酸硫氧化物使ATT不可能与弹性蛋白酶的弹性位点相结合。通过位点直接诱变，Met358被Val代替就成为抗氧化疗法的AAT突变体。含AAT突变体的血浆静脉替代疗法已经用于AAT产物基因缺陷疾病患者的治疗，并已取得明显疗效。3.2在农业方面蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。如植物光合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉，在植物叶片中普遍存在着一种重要的起催化作用的酶，它能固定住二氧化碳，这种酶叫核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶。而这种酶具有双重性：它既能固定二氧化碳，又会使二氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半，即光合效率只有50%。现在，这种酶的三维结构已经搞清楚了。参与研究的工作人员认为，可以通过蛋白质工程改造这种酶，控制其不利于人需要的一面，从而大大提高其光合作用效率，增加粮食产量。近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了10倍。3.3在工业方面蛋白质工程在工业上的应用取得的成果亦是很多。现以改变酶的动力学特性研制出高效除污酶为例说明其应用价值。酶的动力学基本规律为：酶（E）-底物（S）=酶-底物复合物（ES）=酶（E）+产物（P）在这个反应过程中有4个速率常数：E-S=ES=E+P在稳态阶段，ES形成速率与分解速率相等，这个速率就是Km（Michaelis常数）。在数值上，Km等于达到最大速率一半时的底物浓度。Vmax常在反应的初始阶段测定，反应进行中产物浓度将增加，K4则不可忽视，高浓度的底物会抑制酶活性。在底物低浓度时，酶的Km是关键的参数。如在枯草杆菌蛋白酶的活性位点内有一个Met残基，作为去污剂的一种组分，该酶要置于氧化条件下使用。利用位点直接诱变，用其他19种氨基酸的任何一种取代这个Met，这些突变酶在活性方面大不相同，除了CYS代替Met的突变酶外，其他突变酶的活性都下降，而Km值提高。含不可氧化氨基酸（如Cer，Ala或Len）的突变酶在1mol/LH2O中不失活，而Net和CYS酶则迅速失活。研究者正是根据突变酶的动力学特性来确定枯草蛋白酶在去污剂中的应用，以提高其除污效率，加强去污作用。另外，美国、日本等国家的科学工作者利用蛋白质