PCR体系优化入门篇

由于TaqDNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。A镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够，那么TaqDNA聚合酶则无法行使功能(figure1)。过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增。因此，研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1~4mM，每次增加或降低0.5~1mM。扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如，PfuDNA聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低，但其优化范围通常为2~6mM。许多DNA聚合酶产品提供Mg-freereactionbuffer和单独一管25mMMgCl2，这样就可以自行调节Mg2+浓度，优化反应体系。MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层，为获得均一的溶液，在配液的时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步，溶解和混匀，常常会造成实验失败。有些科学家倾向于使用包含MgCl2的buffer，MgCl2的终浓度为1.5mM。值得注意的是有文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM的变化，如果在90℃加热10min，则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。Figure1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。用不同浓度Mg2+测试，产物大小为1.8kb琼脂糖凝胶电泳，EB染色泳道M为MAKER;Lane1,0mMMg2+;Lane2,0.5mMMg2+;Lane3,1mMMg2+;Lane4,1.5mMMg2+;Lane5,2mMMg2+;Lane6,2.5mMMg2+;Lane7,3mMMg2+andLane8,3.5mMMg2+BBuffer缓冲液大多数Buffer里含有一种缓冲试剂，多数为基于Tris的缓试剂。此外还有盐类，通常为KCL。缓冲试剂调节反应体系的pH值，pH值会影响DNA聚合酶的活性和保真度。与不添加KCL的比，适量的KCL能够增加50~60%DNA聚合酶的活性。一般来说，KCL浓度为50mM。C酶浓度我们推荐（promega的科研人员）在50微升体系中使用1-1.25unitsTaqDNA聚合酶。多数情况下，这些酶是过量的，再添加酶并不能显著提高产物量。事实上，酶量不断升高会增加TaqDNA聚合酶5′→3′外切酶活性，跑胶的时候会观察到弥散的条带。想要准确吸取少量的含50%甘油的酶溶液是非常困难的，因此建议一次配置大量的预混液，这样酶的加量便会很大，减少误差。DPCR引物设计引物决定扩增区域和扩增子的大小，引物长度一般在15~30bp。理想状态下的引物其GC含量应该在40~60%，避免在引物3’端出现三个连续的G或C以减少非特异性结合。还要避免自身或者引物间互补，以降低引物二聚体。引物自身二级机构干扰退火时引物与模板的结合。正反向两条引物之间Tm值相差不超过5℃，以便两条引物在同一退火温度下拥有相似的扩增效率。可以在引物上添加其他用途的序列，比如在5’端添加酶切位点序列，方便下一步的克隆，或者添加T7RNA聚合酶启动子，以便进行体外转录。实际应用中会发现不同软件给出的Tm值不同，同一软件不同参数得出的Tm值也不同。不必纠结于此，只需要使用同一个软件统一参数去评估一个项目中所用的引物就好，Tm值只是一个相对的标准，不论哪种软件只要你的所有引物都在一个标准体系内评定，不会影响后续实验的分析。就好比你带两块表反而不知道具体时间，只需要有一个标准参考体系即可。E模板质量扩增依赖DNA模板的数量和质量。核酸纯化过程中经常使用的试剂（盐类、胍、蛋白酶、有机溶液和SDS）是潜在的DNA聚合酶抑制剂。例如0.01%SDS会导致90%TaqDNA聚合酶活性被抑制，而0.1%SDS则会抑制99.9%的TaqDNA聚合酶活性。其他PCR抑制剂有苯酚、肝素、二甲苯蓝、溴酚蓝、植物多糖和多胺类物质精胺和亚精胺。有些情况下，抑制剂并不是随着核酸模板进入反应体系内的，例如紫外照射下的聚苯乙烯和聚丙烯会释放抑制物，如果使用此类物质作为反应管，有可能干扰PCR。如果你觉得扩增失败是由于模板溶液中存在抑制剂，那么向反应液中再加入以前扩的很好的对照DNA模板和引物对，如果扩增效果变差，那可能就有干扰物质，清理DNA模板，重点检查苯酚、氯仿和乙醇等。F模板量扩增所需的模板量依赖于DNA样本的复杂性。例如，4kb的质粒含1kb的目的序列，那么靶序列的含量就是25%。相反如果1kb的目的序列存在于人基因组中（3.3×109bp），那么靶序列的含量就是0.00003%。一般常犯的错误就是使用太多的质粒DNA，太多的PCR产物或太少的基因组DNA作为模板。加太少模板扩增产物极少，而加太多模板则会造成非特异性扩增过多。在使用PCR产物作为模板的时候，应当稀释10至10000倍然后再进行PCR扩增。1μgofhumangenomicDNA=3.04×105moleculesG循环参数退火温度和延伸时间是经常需要改动的两个参数。其他步骤的时长和温度一般变化不大。但是在个别情况下，循环过程中的变性温度会降低，时间会减少，以减低脱嘌呤作用（脱嘌呤作用可因此产物突变）。退火温度一般设在引物Tm值5℃左右，使用比引物Tm值稍高的退火温度可以提高特异性，减少非特异扩增。但是较低的退火温度会增加扩增产物的量，因为引物在较低温度下更能有效退火。建议以低于引物5℃的Tm值为退火温度，逐渐升高以找到最优退火温度。热启动酶在一定程度上能够减少非特异扩增和引物二聚体。延伸时间要根据扩增产物的大小来优化，一般情况下1min扩增1kb。时间不要过长，过长容易增加5′→3′外切酶活性，造成条带弥散。HPCR促进剂和添加剂PCR促进剂可以增加目标产物的扩增量，减少非特异性产物的扩增量。现有许多作用机理各不相同的PCR促进剂，这些促进剂并不会对所有PCR反应有促进作用。模板和引物不同，促进剂的效用也不尽相同，因此需要通过具体实验来验证。以下讨论常用的促进剂：甜菜碱、DMSO和甲酰胺能够促进高GC含量模板的扩增。高GC模板通常会形成较强的二级结构，DNA聚合酶扩增停止，导致扩增失败。高GC模板之所以会成为一个难点是因为其两条链不容易分离，分离后又很容易结合。而高GC含量引物会在分子间形成二级结构，与模板结合过程竞争。甜菜碱能够减少模板解链所需能量。DMSO和甲酰胺作用相似，都是干扰两条单链DNA间氢键的形成，阻止模板两条单链互补结合。如果扩增效率很差，添加适量的促进剂可以增加扩增产物量，促进剂的加量范围为：甜菜碱（1M）、1—10%DMSO/甲酰胺。DMSO含量超过10%，或甲酰胺含量超过5%则会抑制TaqDNA聚合酶的活性。有些情况下，通用添加稳定剂如BSA（0.1mg/ml），明胶（0.1-1.0%）和非离子型去垢剂（0-0.5%）能够解决扩增失败的问题。这些稳定剂可以增加DNA聚合酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。BSA还能帮助克服黑色素对反应的抑制。非离子型去垢剂如Tween-20，NP-40和TritonX-100能够克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂（如0.01%SDS）对PCR反应的抑制作用。铵离子能偶增加扩增反应对非优条件的耐受性，因此一些PCR反应试剂中包含10-20mM(NH4)2SO4。其他PCR促进剂有甘油（5-20%），聚乙二醇（5-15%）和氯化四甲基铵（60mM）I核酸交叉污染尽可能的降低核酸在实验间的交叉污染相当重要。要对实验场所进行分区，并在每一区配备专属移液器等器材。使用低吸附枪头或项目专用移液枪也能减少交叉污染。异补骨脂素，一种光敏交联试剂，能够嵌入DNA双链，可阻止DNA双链变性和复制。因此预先用异补骨脂素处理PCR试剂，可有效防止试剂中存在的污染双链DNA在PCR过程中变性，只能扩增添加的未经过异补骨脂素处理的样本DNA。尿苷酶(UNG)，一种DNA修复酶，能够把尿嘧啶从核糖上水解下来。利用其这一特性，在PCR体系中使用尿嘧啶（dUTP）代替胸腺嘧啶dTTP，那么扩增产物中便包含dUTP。在反应体系中加入UNG，运行PCR程序的时候（一般在PCR反应程序前加入10min37℃的预处理，来使UNG发挥作用），UNG将会切割体系内混入的含dUTP的扩增产物，阻止其扩增，以达到降低污染的目的。有校正功能的聚合酶如果使用dUTP效率将会降低（高保真酶），而没有校正功能的聚合酶在含有dUTP的体系内能够稳定扩增（比如Taq酶）。使用dUTP对EB染色和电泳迁移率无显著影响（很多公司有含UNG的Taqman探针反应体系，dUTP对Taqman探针应该无显著影响，需查文献）。UNG处理还有一个优势就是它可以处理单链DNA也可以处理双链DNA。减少错误的最佳方法永远是规范化的操作。污染也是如此，规范化标准化的实验室操作会尽可能的降低污染的可能性。有两方面需要注意，一是加样的时候，一定要左手拿离心管，右手去开盖，而且动作要慢稳，避免管内液体飞溅；二是废弃枪头一定要打入含水的垃圾袋内，实验操作完成后，尽快密封垃圾袋，并丢弃到垃圾桶内。工作台的整洁直接体现实验操作人员的专业素养，关乎实验的成败。请在每次实验操作完成后认真整理实验台。规范化标准化的操作可能会花费更多的时间和金钱，但是这是值得的。从短期来看，可以避免失误、污染和其他容易造成实验失败的因素；从长远来看，规范化标准化的操作能够提高实验人员的专业素养，增加实验结果的准确性、重复性和分析性，反而能够高效快速的完成研发项目。千万不要在专业素养还没有形成前，就急不可耐的随意操作。不坚持原则，爱走捷径，被毁掉的不止是一次试验、一个项目，更是你的职业生命和前途。在无法看到结果，没有人指导你的情况下，坚持原则是你唯一的正确选择。