Elisa检测-人γ干扰素-IFN-γ原理步骤

BeijingBLKWBiotechnologyCo.,Ltd.用双抗体夹心ELISA法检测样本中IFN-γ的浓度IFN-γ简介：被称为II型干扰素的IFN-γ，是由143个残基构成的，有20和25kDa亚型的糖蛋白，以头尾相连的同型糖蛋白的形式存在。IFN-γ由T淋巴细胞和NK细胞产生，用以抗病毒和干扰增殖，此外，IFN-γ还有与免疫调节相关的几种功能包括调节细胞的增殖和程序性死亡，刺激或抑制不同基因的表达。IFN-γ能通过诱导产生吲哚胺2，3-双加氧酶来抗弓形虫和衣原体的感染。IFN-γ是效应强烈的单核吞噬细胞增强剂，IFN-γ是通过增强单核吞噬细胞的的Mac-1的表达来达到增强胞饮作用和吞噬作用的。IFN-γ通过增加巨噬细胞的氧自由基和TNF-α的释放来达到增强杀肿瘤细胞的作用。IFN-γ选择性地提高包括因LPS刺激的B细胞的IgG2a和因2型T细胞呈递抗原而引起的B细胞的IgG3的释放量。有报道称IFN-γ能引起细胞的自分泌IFN-γ作用的增强。检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IFN-γ的浓度。IFN-γ捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IFN-γ会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IFN-γ抗体后，抗人IFN-γ抗体与IFN-γ接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IFN-γ将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IFN-γ浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IFN-γ浓度。标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测；D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。注意事项:1.试剂盒请保存在2～8℃。2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。3.若标准品复溶后，请在三天内用完。4.底物请勿接触氧化剂和金属。5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。8.室温反应，请严格控制在25～28℃。9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。11.加样过程中避免气泡的产生。12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。BeijingBLKWBiotechnologyCo.,Ltd.检测前准备工作:1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。3.标准品:加入标准品稀释液0.25ml至冻干标准品瓶中使IFN-γ终浓度达到1000pg/ml，静置15分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）洗涤方法:自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。实验过程需自备的材料：1.不同规格的加样枪及相应的枪头；2.酶标仪；3．自动洗板机；4．去离子水或双蒸水；操作步骤:1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60分钟。6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。7.加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20分钟。8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温孵育20分钟。10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。结果判断:1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。