分子克隆技术

分子克隆技术限制性内切酶特定的识别序列，4~6个碱基对在识别序列内固定位置切割，5'-端磷酸基因，3'-端羟基基团切割后形成粘性或平滑末端…CATCGACGAATTC…GTAGCTGCTTAAGGAATTCTGCCAGGT…EcoRI酶切位点双链切开CTTAAGACGGTCCA……CATCGACGAATTCGCTTAAGACGGTCCA…AATTCTGCCAGGT…GDNA连接酶形成新的DNA双链…GTAGCTGCTTAAAATTCTGCCAGGT..…CATCGACGGACGGTCCA....GTAGCTGCTTAA限制性内切酶和DNA连接酶质粒细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达分子2000~50000bppGEM-TvectormapSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCI构建质粒的特点Ori区：复制起点Par区：保证质粒均匀分布于子细胞多克隆区：人为构建，便于克隆操作选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选接合在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA转化外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。转录利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。分子克隆常用技术DNA电泳基因转移核酸杂交聚合酶链反应PCRDNA电泳可分离不同分子量的DNA对临床菌株的第二次PCR扩增产物电泳图谱分析Lane1~7:临床菌株S.sobrinus;Lane8~14:临床菌株S.mutans.Ladder1234567891011121314Ladder(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸杂交原理：在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股SouthernBlot电泳、转移、杂交确定分子量斑点杂交目标序列的存在目标序列的量聚合酶链反应PCR细菌形态生化反应免疫反应分子生物学方法----分子探针杂交----RFLP----PCR唾液在与龋病相关微生物检测中的应用与龋病相关微生物的定量检测方法•在人类口腔中检出率很高•茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切变形链球菌和茸毛链球菌唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌.谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵.中华口腔医学杂志，2003，38：223-226唾液在与龋病相关微生物检测中的应用套式PCR（NestedPCR）5′3′TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′3′Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′3′ThesecondPCRproduct本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR抽提细菌染色体DNA（Igarashietal.1996）----细菌----唾液PCR反应过程第一次PCR反应预变性:94℃4min变性:94℃1min退火:51℃1min30cycles延伸:72℃2min最后延伸:72℃5min第二次PCR反应abcdefghLadder12345678选择外引物行第一次PCR后扩增产物电泳图谱分析以变链菌组(MutansStreptococci)染色体DNA为模板Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5abcdefghLadder12345678选择内引物行第二次PCR后扩增产物电泳图谱分析Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000LadderMW(Kb)2.00.750.51.00.250.1Ladder123456第一次PCR的灵敏度变形链球菌S.mutansIngbritt的数量Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.252.00.5Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的灵敏度变形链球菌S.mutansIngbritt的数量Lane1:104CFU,Lane2:103CFULane1.chromosomalDNAfromS.mutansIngbritt;2.chromosomalDNAfromS.sobrinus6715;3.salivasamplefromsubjectA;4.salivasamplefromsubjectB;5.salivasamplefromsubjectC.利用PCR直接从唾液样本中检测变形链球菌S.mutans和茸毛链球菌S.sobrinus(图A)利用外引物(图B)利用内引物Ladder12345LadderMW(Kb)2.01.00.750.5A0.250.1BLadder12345LadderMW(Kb)1.00.750.50.250.1RealTimePCR在PCR反应体系中加入能结合到扩增产物上的荧光物质，并通过RealTimePCR检测系统对PCR反应过程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法适应于定量RealTimePCR应用基因表达分析（mRNA）SNP分型基因拷贝数变化（DNA）转基因食物的定量分析……RealTimePCR原理（一）PCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久到达平台期。起始的DNA量越多扩增产物便越早达到阈值，也就是扩增曲线越早起峰。将已知浓度的标准品梯度稀释进行RealTimePCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列曲线。Ct值RealTimePCR原理（二）再由Ct值（达到阈值时的循环次数）与起始模板量的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图所示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，也可以得到Ct值，将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量。未知样品浓度分子克隆的主要步骤基因文库的建立目的基因的筛选目的基因的分析原核生物基因文库的建立提取细胞DNA限制性内切酶酶切DNA片段连接至质粒或噬菌体转化宿主细胞（大肠杆菌）目的基因的筛选核酸杂交免疫学检测目的基因的分析DNA序列启动子分析推测蛋白质一级结构推测蛋白质二级结构