2012届高三生物一轮精品复习学案1.1DNA重组技术的基本工具、基因工程的基本操作程序(人教版选修

专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序【高考目标导航】1、基因工程的诞生2、基因工程的原理及技术【基础知识梳理】一、基因工程的工具1、基因工程的概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。2、DNA重组技术的基本工具（1）限制酶全称：限制性核酸内切酶来源：主要从原核生物中分离纯化出来特点：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。结果：产生黏性末端或平末端（2）DNA连接酶类型：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶作用：连接双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二脂键。（3）载体种类：通常利用质粒作为载体，另外还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等质粒：化学本质：小型环状DNA分子特点：能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取途径（1）目的基因：编码蛋白质的结构基因。（2）获取目的基因的方法：从基因文库中获取利用PCR技术扩增目的基因通过DNA合成仪人工合成（3）PCR技术扩增目的基因①原理：DNA双链复制②过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。2、基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（如抗生素基因）①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。3、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→微生物细胞壁的通透性增加→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4、目的基因的检测与鉴定（1）利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无（2）利用分子杂交技术检测目的基因的转录（3）利用抗原—抗体杂交检测目的基因的翻译（4）利用个体生物学水平的检测鉴定重组性状的表达【要点名师透析】一、基因工程的工具1、与DNA有关的酶（1）四种酶的比较(2)限制酶和DNA连接酶之间的关系图示2.载体(1)作为载体的条件①能在宿主细胞中稳定保存并大量复制。②有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有特殊的标记基因，便于筛选。(2)种类①质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。②λ噬菌体的衍生物。③动植物病毒。(3)作用①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取(1)直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或cDNA文库中获取。(2)人工合成目的基因①如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。②以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。2.基因表达载体的构建(1)基因表达载体各个组成的作用①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，能使转录在所需要的地方停下来。③标记基因：作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因。(2)基因表达载体的构建步骤3、将目的基因导入受体细胞受体细胞：细菌↓氯化钙细胞壁的通透性增大↓重组质粒进入受体细胞↓目的基因随受体细胞的繁殖而复制4、目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测①导入检测：DNA分子杂交技术，用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针。②转录检测：分子杂交法，用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。③翻译检测：抗原─抗体杂交法。(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。【感悟高考真题】1、(2011·浙江高考)将ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子【解析】A项，ada为目的基因，大肠杆菌为受体细胞，将目的基因导入大肠杆菌时如果能成功表达说明每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒；B项，要让目的基因与质粒形成重组质粒，两者必须用同种限制性核酸内切酶切割，所以每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点；C项，质粒作为运载体的条件之一是有多种限制性核酸内切酶的识别位点，但每种限制性核酸内切酶只有一个识别位点，只能插入一个目的基因（ada）；D项，ada导入大肠杆菌成功的标志是表达腺苷酸脱氨酶，因此每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。【答案】C2、(2011·海南高考)回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生（相同、不同）黏性末端的限制酶。（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成，常用抗原—抗体杂交技术。（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的上。【解析】（1）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。（2）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原—抗体杂交技术。（3）基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把目的基因插入到染色体的DNA分子中。【答案】（1）平相同（2）RNA聚合酶识别和结合的部位Ca2+分子杂交技术蛋白质（3）T—DNA染色体DNA3、（2010·全国2高考）下列叙述符合基因工程概念的是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上【解析】A:属于动物细胞工程的内容C:属于微生物的发酵工程的内容D:自然状态下，一般不能自行形成重组DNA分子【答案】B4、（2010·江苏高考）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有▲个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越▲。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SrnaⅠ切割，原因是▲。（4）与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止▲。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入▲酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了▲。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在▲的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。【解析】本题考查基因工程的限制性内切酶的作用特点（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被改酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。（2）由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成二个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性就越高（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA（4）只使用EcoRI，则质粒和目的基因两端的粘性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切时，质粒和目的基因两端的粘性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。（5）质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。（6）质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。（7）将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，含有重组质粒的个体才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作为唯一碳源的培养基进行培养受体细胞，含有重组质粒的细胞才能存活，不含有重组质粒的因不能获得碳源而死亡，从而达到筛选目的。【答案】（1）0、2（2）高（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化（5）DNA连接（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞（7）蔗糖为唯一含碳营养物质5、（2010·浙江高考）在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是（A）A.用限制性核酸内切酶切割烟草茶叶病毒的核酸B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C.将重组DNA分子导入原生质体D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞【解析】本题考查基因工程的有关知识，基因工程的一般过程：①用限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA分子（除草剂基因）和运载体（质粒），②用DNA连接酶连接切割好的目的基因和运载体③重组DNA分子导入受体细胞，因为是植物可以说是原生质体④用相应的试剂和病原体帅选转基因细胞⑤用植物组织培养技术抗除草剂的转基因烟草（表达）。【答案】A6、（2009·浙江高考）下列关于基因工程的叙述，错误．．的是A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达【解析】基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。【答案】D7、（2009·广东理基）钱永健先生因