流式protocol

流式细胞仪检测细胞表面标记：收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4℃离心，1000r/min，5min。↓用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞。↓各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。↓同时每管样品设立同型阴性对照。↓避光冰上孵育45min。↓用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500μLPBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。（四个CD抗原分子，四个阴性对照，一个空白对照。九个EP管）细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。阴性对照的设置：在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。空白对照：即不进行任何标记的细胞。但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体，那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体，那它们的同型对照怎么设置？我们的样品可以放在EP管里面吗？检测时，样品至少需要多少量？BMSCs表面标志物的流式细胞仪鉴定取第3代第3～5dBMSCs，胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液；↓PBS（1到2ml）洗三次，离心，1000rpm，5min弃液；↓4%多聚甲醛1ml室温下固定40min，1000r/min,离心5min后弃去上清液↓PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；↓分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体；↓避光孵育30min↓用PBS洗涤细胞两次，以除去未结合抗体；↓用PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失？解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。Directflowcytometry(FACS)protocolGeneralprocedureforflowcytometryprocedureusingaconjugatedprimaryantibody1.Harvest,washthecellsandadjustcellsuspensiontoaconcentrationof1-5x106cells/mlinicecoldPBS,10%FCS,1%sodiumazide.Cellsareusuallystainedinpolystyreneroundbottom12x75mm2Falcontubes.However,theycanbestainedinanycontainerforwhichyouhaveanappropriatecentrifugee.g.testtubes,eppendorftubes,and96wellroundbottomedmicrotiterplates.Ingeneral,cellsshouldbecentrifugedsufficientlysothesupernatantfluidcanberemovedwithlittlelossofcells,butnotsothecellsaredifficulttoresuspend.Werecommendstainingwithicecoldreagents/solutionsandat4oC,aslowtemperatureandpresenceofsodiumazidepreventthemodulationandinternalizationofsurfaceantigens.Whichcanproducealossoffluorescenceintensity.2.Add0.1-10μg/mloftheprimarylabelledantibody.Dilutions,ifnecessary,shouldbemadein3%BSA/PBS(Propidiumiodidecanalsobeaddedatthispointfordeadcellexclusion).3.Incubateforatleast30minatroomtemperatureor4oC.Thisstepwillrequireoptimisation.4.Washthecells3Xbycentrifugationat400gfor5minutesandresuspendthemin500µlto1mloficecoldPBS,10%FCS,1%sodiumazide.Keepthecellsinthedarkoniceorat4oCinafridgeuntilyourscheduledtimeforanalysis.5.Forbestresults,analyzethecellsontheflowcytometerassoonaspossible.Werecommendanalysisonthesameday.Forextendedstorage(16hr)aswellasforgreaterflexibilityinplanningtimeonthecytometer,resuspendcellsin1%paraformaldehydetopreventdeteriorationFixation:Ifyouneedtowaitlongerthanforanhour,youmayneedtofixthecellsafterstepthree.Thiscanpreservethemforatleastseveraldays.(Thiswillstabilizethelightscatterandinactivatemostbiohazardousagents).Controlswillrequirefixationusingthesameprocedure.Cellsshouldnotbefixediftheyneedtoremainviable.Thereareseveralmethodsavailable,pleaserefertofixationintheIndirectStainingprotocol.Thefixationfordifferentantigenswillrequireoptimisationbytheuser.三、骨髓MSCs的流式鉴定1.取培养的第3代骨髓细胞，吸弃原培养基，pbs液漂洗2遍。2.每皿加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)1ml，室温消化2min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基中和，吹打细胞成悬液。3.移入15ml离心管中，800转/min×5min，吸弃上清液，4.PBS洗涤，800转/min×5min，2遍；洗涤完后加入PBS反复吹打成细胞悬液。5.用300目细胞筛过滤，计数过滤后的细胞数。6.按每1×106个细胞分别移入1.5mlEP管中，每管分别加入CD34-PE抗体、CD44-FITC抗体、CD45-PE抗体、CD90-FITC抗体及其同型对照抗体。7.避光条件下37℃孵育30min。8.PBS洗涤，800转/min×5min，3遍。9.每管重悬为200μl细胞悬液，行流式细胞分析。a)大鼠以10％水和氯醛腹腔麻醉，剂量为O．33~0．36ml／100ml，麻醉满意后仰卧固定于手术台上。b)手术剪于胸骨剑突处剪开胸腔，“V字形剪断肋骨，两侧肋骨拉开固定，暴露肺和心脏。c)50ml注射器吸满生理盐水，连接钝头粗针备用。d)小心剪开心包膜，尽量避免小血管的损伤，剪开右心耳，同时粗针经心尖刺入主动脉，开始灌注。e)首先以生理盐水150-200ml经主动脉快速灌注，直至右心耳内流出清亮无色液体，同时肝脏由紫红色变为土褐色。f）换4％多聚甲醛液继续灌注，约需250ml，前100ml速度快，至出现肌颤后开始缓慢推注，共约需20分钟。g）触肝脏坚韧，四肢僵硬，灌注成功，开颅取脑置于装有4％多聚甲醛液的标本储存瓶中。h)脑标本在4％多聚甲醛液中固定24小时以上，供病理组织学观察。