人胰岛素的制备

人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1,细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。2，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入BufferOBB，OligotexSuspension，打匀。70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-freewater，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物：5’-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccaccaccaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3’后端引物：5’-agtgtcgacttagttgcagtagttctccagctggta-3’二、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。１.双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。２.重组过程pQE--30用HindⅢ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用HindⅢ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的HindⅢ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的HindⅢ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。三、构建基因工程菌(一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链同时表达法将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA的转化1,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：取100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体，用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心，收集菌体，用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液悬浮菌体，冰浴放置12-24小时，备用。2，大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组，DNA连接液，混匀。冰浴放置半小时。在42℃保温2分钟（热脉冲），快速将转化细胞转移至冰浴中放置1–2分钟。加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）。涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。经典的CaCl2转化方法：a将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。b弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。c弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。d感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃。e从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。f加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。g42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。h向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。i将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。(二)重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测）1.初筛选随机挑取转化单菌落，在LB／AK培养基(含100pg／ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素)中进行培养，用O.5mmol／LIPTG诱导表达。表达情况用16．5％SDS．PAGE进行分析。2.重组菌的后续鉴定直接电泳检测法将初筛选获得的重组菌扩大培养后，提取其质粒DNA，通过PCR对其进行扩增，利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，用电泳法检测质粒是否为重组质粒。目的蛋白表达检验所得菌体经溶菌酶／超声破碎细胞后得到的包涵体进行SDS—PAGE分析，所需基因工程菌表达的外源蛋(His)6·Arg-Arg-人胰岛素原以包涵体形式存在，其分子大小约为13kb，经电泳与胰岛素原marker对比，如条带显示有所需目的蛋白，则所得菌既可做工程菌使用，经扩大培养后，斜面保存以便后续使用。3.工程菌的保藏15%甘油保存菌种，菌液=20:80,,充分混匀后,-70度保藏。四、培养工程菌优化发酵条件采用比浊法测定不同时间培养基中菌量，绘制基因工程菌的生长曲线，在摇瓶培养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌，培养4小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延长至17小时。1，正交优化实验：采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化，该七个因素为：种子活化方式，摇床转速(通风量)，IPTG诱导温度，接种量，IPTG添加量，诱导时间，补料方式。分别用A、B、C、D、E、F、G表示．以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量，考察条件优化的效果，进行八次实验，对实验结果进行分析，优化出最佳实验条件。2，其他条件优化：在优化发酵条件的基础上，进一步就各种金属元素对苗体生长发重组蛋白诱导的影响作了分析。3，放大培养（比较不同发酵工艺产量）：在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至1L培养基中比较两种发酵工艺。在不同转速，通气量，pH条件下，比较选择产量最高的发酵工艺。五、产物分离纯化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。发酵液进行细胞分离，分别得到胞内产物和胞外产物。胞外产物直接进行透析浓缩然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化，最后制剂即可。胞内产物用溶酶菌或超声波将细胞破碎，细胞破碎后用高速离心法进行固液分离。分离后用变性剂或者离子去污剂得到包含体，再用变性剂（尿素）使其变形，接着用二次复性法将其复性。对复性后的产物进行透析浓缩，然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化，最后制剂即可。重组蛋白分离纯化的特点重组蛋白质分离纯化的特点为：(1)大多数重组蛋白质产品是生物活性物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活a(2)重组蛋白质产品在物料中含量很低，凰物料组成非常复杂。例如，利用基因工襁菌发酵生产蛋白藤，物料中含有大量缀成复杂的培养基、荣体生产代谢物等，疆拣蛋鑫囊魏含量嚣豢不瑟蛋鑫凄慈爨鹃1％。舂些嚣拣鬣囊矮存在予缀懿武或在胞内形成包含体，为获敬蛋白质，还需避行细脆破碎，结鬈物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。(3)含蛋白质产晶的物料不稳定，蛋白质产品易受料液中蛋自水解酶降解。(4)很多熏组蛋白质产品作为医药、食品被人炎利用，因而要求蛋国艨产器必绥是裹癀缝铯瓣，产蘸无萤、兹致热源等。与传统麓生物大分子分离方式楣镄，蘩缀蛋臼的分离纯纯恣憝秘用其携理稻化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、祭疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。二次复性法：0．5g包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmol／LGly—NaOH，8mol／L尿素，B_巯基乙醇，pH9．5)中，使之充分混悬，静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液C(50mmol／LGly-NaOH，半胱氨酸一胱氨酸，pH9．5)中，4℃静置复性过夜。上样于已用50mmol／LGly—NaOH(pH9．5)平衡的DEAE-SepharoseFF柱，用0．1mol／L的氯化钠梯度洗脱，通过SDS-PAGE确定RRhPI位置，用DEAE-SepharoseFF做离子交换层析，收集含RRhPI的洗脱峰2，层析图谱见（图6）。电泳检测显示(图11)峰2主要为RRhPI，及少量高分子杂质，收集峰2做再复性。峰1为pH高于9．5及一些疏水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分pH低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上，在较高盐浓度及2mol／LNaCl的条件下被洗脱下来，形成其他峰3和峰4。胰岛素原（RRhPI）的再复性及酶切转化：1,复性将初步复性及纯化后的RRhPI通过透析浓缩，先后转换到缓冲液B和D(50mmol／LG1y-NaOH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)一还原型谷胱甘(GSH)pH9．5)中，使蛋白浓度为0．1～O．6mg／ml，4℃静置过夜。2,酶切复性后的RRhPI复性液调节pH后加入一定量的胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptidaseB)在37。C进行协同酶切一段时间，然后滴加2mol／LZnCI：至ZnCl：浓度为0．1mol／L终止反应并沉淀生成的hI，用双蒸水洗涤沉淀得较纯B9重组人胰岛素约79mg/L培养基。重组胰岛素粗品的纯化：胰岛素粗品用0．2mol／LNaAc·HAc，pH4．0溶解。溶解后的样品通过Superdex75进行纯化(图10)，得1、2、3峰，收集峰3，透析后冻干即为胰岛素产品所得胰岛素产品用SDS-PAGE分析为单带，电泳检测见图。六、除菌过滤传统过滤只能滤去空气中的尘埃、液体中的异物微粒，很难去除微生物活体（细菌、病毒及热原体）；薄膜过滤是微孔筛分，大于孔径的微粒均被截留，微生物粒子大小为0.5-2微米，只要选用0.45微米的微孔滤膜即可将微生物截留去除，用0.22微米的微孔滤膜则可能将病毒、热原体去除。。注射用药液除用传统过滤器去除药液中的异物外，现已采用微孔滤膜将澄清的药液再次除菌、除热原，其滤膜孔径最好在0.22微米以下。制药空气的过滤亦因GMP的不同级别要求而采用相应的器材、过滤器。要指出的是，制药无菌空气的供应仅采用传统滤材、滤器往往不能达到要求，其终端必须选用微孔薄膜，孔径必须在0。45微米以下。注射用无菌药液的处理：按GMP要求，注射用药液应当无菌无热原，本品药液配制好后，经过粗砂棒、细砂棒（适当使用滑石粉或碳粉）过滤成澄明液后，再经过0.45微米多层微孔滤芯除菌，终端通过0.22微米单层超微孔滤膜后上机灌装。目前，用于过滤器常用的主要过滤材料大致有以下几种：混合纤维素酯常用来制成圆形的单片平板滤膜，用于液体和气体的精过滤；聚丙烯(PP)做成折叠式，常用于筒式过