各类生物制品的分离纯化方法

复习：生物制品：生物制品系指以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织作为起始材料，采用生物学工艺或分离纯化技术制备，并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂。包括疫（菌）苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球胆白、抗原、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品、体外免疫诊断试剂等，供某些疾病的预防、治疗和诊断用。第二节各类生物制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化概述蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16.3%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的存在广泛存在于生物体内：肌肉、皮肤、发、毛、蹄、角——主要成分都是蛋白质蛋白质是组成细胞的基础物质构成人体的物质基础植物种子、酶、激素、血红蛋白、细菌、病毒、抗体——都含蛋白质1.根据分子形状和大小不同进行分离：如离心、超滤2.根据分子电离性质（即带电性）的差异进行分离：如离子交换法、等电点沉淀法（即酸沉、碱沉）（一）分离纯化蛋白质的主要原理是：3.根据分子极性大小及溶解度不同进行分离：如有机溶剂分级沉淀法（即醇沉）、盐析法。4.根据物质吸附性质的不同进行分离：如吸附层析法。5.根据配体特异性进行分离：如亲和层析。（二）分离纯化常用方法1.有机溶剂沉淀法（醇沉）：原理：在溶液中，生物大分子自身所带的电荷能与水相互作用，在大分子表面形成水化膜，保证了生物活性物质的稳定性。但在水溶液中加入有机溶剂（如乙醇）后，有机溶剂会破坏大分子表面的水化膜，另外，加入有机溶剂会使溶液的极性减小，生物大分子在溶液中的溶解度就会降低，从而产生沉淀，这样目的物就从水溶液中沉淀而分离了出来。有机溶剂的选择：有机溶剂沉淀法常用的有机溶剂为乙醇，因为乙醇在水中的溶解度大，毒性小，操作方便。用乙醇去沉淀生物大分子就是我们常说的醇沉。例如应用乙醇分离血浆蛋白，控制乙醇浓度在8%时得到血纤蛋白原，乙醇浓度在25%时得到丙种球蛋白，乙醇浓度在40%时得到α、β球蛋白。2.等电点沉淀法（酸沉、碱沉）原理：多数的生物活性物质都是带电物质，都有自己的等电点，这些带电基团所带电荷的数量与PH密切相关。当溶液的PH大于生物大分子的等电点时，该物质带负电荷；当溶液的PH小于物质的等电点时，该物质带正电荷，当溶液的PH等于物质的等电点时，该物质的净电荷为零，此时的生物大分子溶解度最低，会聚集到一起形成沉淀而从溶液中析出。方法：溶液的PH达到目的物的等电点时，目的物就会沉淀分离，所以向含有生物活性成分的溶液中加入酸或碱，来调节溶液的PH，使溶液的酸碱度达到工艺要求，就能使目的物沉淀而分离出来。这就是平时常说的酸沉与碱沉。3.离心分离法在固相和液相混合体系中，要把两相分离开来，通常有两种方法，一种是过滤，一种是离心。离心是分离技术中最常用的方法之一，它对于固体颗粒小，溶液粘度大的溶液以及细胞培养液或生物材料的大分子抽提液是十分有效的，尤其是对于用一般过滤难以奏效的物质，采用离心技术可达到分离的目的。尤其是高速和超速冷冻离心机的相继问世，离心已成为生化、生物工程、生物制药的分离纯化的重要方法。原理：离心分离时的样品物质通常是悬浮在某一特定的液相介质中，由此而形成的固液悬浮体系，将该体系放入离心机的离心管内，开机后样品物质做匀速圆周运动，于是就产生了一个外向离心力。而由于不同颗粒的质量、密度、大小不同，在同一液相介质和相同的离心力场下，沉降速度各不相同，颗粒由大到小沉淀，这样就会产生分层，从而达到彼此分离。离心机类型普通离心机：转速不超过6000转/每分钟高速离心机：最大转速为25000转/每分钟超速离心机：最大转速为25000转/每分钟以上。4.超滤分离法原理：超滤分离法是以压力为推动力的膜分离法的一种，原理是根据被分离物质的分子颗粒大小，选择孔径不同的半透膜。使一定大小的分子透过，而阻碍另一种物质或分子量较大的物质透过。此法的实质是各种物质的分子大小不同，能通过的半透膜的孔径也就不同，从而能够分离。超滤是分离生物活性物质常用的方法，此外还有透析法、反渗透法等，都是利用各种半透膜的选择透过性进行分离的技术。超滤装置，有板式、管式、卷式、中空纤维式等形式。中空纤维式其他常用的分离纯化生化物质的方法：5.盐析法6.亲和层析法7.吸附法8.电泳法二、核酸类制品的分离纯化•核酸是重要的生物大分子化合物，所有的有机体中都含有核酸。核酸占有机体细胞干重的5％～15％。•核酸是生物体遗传和变异的物质基础。对遗传物质DNA、RNA的研究，尤其是利用DNA重组技术进行的基因工程的研究一直是生物工程中的热点和重点问题。核酸是由核苷酸组成的具有复杂三维空间结构的大分子化合物，是遗传的物质基础。核酸分为两类，一类是脱氧核糖核酸（DNA），主要存在于细胞核的染色质中，另一类是核糖核酸（RNA）主要存在于细胞质中。RNA按结构和功能不同又可分为三类：核糖体RNA，信使RNA和转运RNA。概述核酸类药物可分为两大类：一类是具有天然结构的核酸类药物，这类物质有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，修复受损伤的组织，所以这类药物已广泛用于放射病、血小板减少症，白细胞减少症、急慢性肝炎和肌肉萎缩等疾病。另一类核酸类药物为天然核酸的类似物或衍生物，这类药物具有干扰肿瘤、干扰病毒代谢的功能，因此在治疗病毒性疱疹、艾滋病、肿瘤方面有一定的疗效。1.RNA的提取与分离（1）材料的选择：制备RNA的材料大多选取动物的肝、肾、脾等核酸量丰富的组织。工业生产上主要用啤酒酵母、面包酵母等真菌的菌体为原料。（2）提取A:乙醇沉淀法:将核糖核蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，然后加入少量辛醇的氯仿溶液，并连续震荡，以沉淀除去蛋白质杂质。去沉淀留上清液，加入规定量乙醇使RNA沉淀析出即得。B:去污剂处理法：在核糖核蛋白溶液中加入去污剂，使蛋白质沉淀，过滤得上清液，再加乙醇使RNA沉淀。常用的去污剂有SDS（十二烷基磺酸钠）、氯仿等。3.RNA药物的用途：用于精神迟缓、记忆衰退。2.DNA的提取与分离（1）材料的选择：制备DNA的材料一般用小牛胸腺或鱼精，这类组织的细胞体积较小，如鱼精，整个细胞几乎全部被细胞核所占据，细胞质的含量极少故这类组织的DNA含量较高。（2）提取将含有DNA的沉淀物用0.14mol/L的氯化钠溶液反复洗涤，尽量除去RNA，然后用生理盐水溶解沉淀物，并加入到去污剂SDS溶液中使DNA与蛋白质解离、变性。冷藏过夜，再加入氯化钠使DNA溶解，过滤取上清液，加入乙醇使DNA析出，反复几次可得到高纯度DNA.3.DNA药物的用途：有抗放射作用。三、糖类药物的分离纯化糖的分类：按分子组成可分为单糖双糖多糖葡萄糖、果糖乳糖、蔗糖、麦芽糖淀粉、纤维素、糖原（一）单糖及其衍生物的制备1.提取：单糖易溶于冷水和温乙醇中，可用水及50%乙醇提取，2.提纯：用醋酸铅盐析除去蛋白质杂质。（二）多糖的分离与纯化•1.提取：•（1）难溶于水、可溶于稀碱液者：碱提醇沉。•（2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者：热水提取，离心去除杂蛋白，再加乙醇沉淀得多糖。•（3）粘多糖的提取：因大部分多糖与蛋白质结合，因此需要先酶解或碱解去蛋白，再用水或盐溶液提取，用乙醇沉淀得多糖。•2.纯化•醇沉完的多糖仍有少量的蛋白质，和小分子杂质，去掉杂质蛋白质的方法有等电点沉淀法、加热变性法等；去掉小分子杂质最常用的方法是透析和超滤法，特别是超滤适合于大规模生产。