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3.0117评DNAdNTPTaqDNA酶馏PCR缓氯镁PCR仪枪PCR聚合酶链式反应(PCR)标签酶链应PCRPCR术1检验处隐亚临态2检测变检测达3临应检测贫变实验PCR术DNA过赖补PCR变----应骤构DNA变DNA经热94℃时间DNA链经PCR扩链DNA为单链结为轮应备DNA()DNA经热变单链55℃DNA单链补对结DNA--结Taq酶dNTP为应为对DNA链补链环变----过获“链”这链为环环24钟23时扩扩实验试剂试剂仪实验骤刚刚觉简单现mix扩时间mix调样过说设计pcrmix扩还juhong661觉简单换MIX结sun53觉难设计赵栋20123觉值习lgchun3觉难现PCRmix酶对实验raulw20033觉PCRqinxuemei198710chentingmd赵栋2012caolichong孙谁这实验谁这实验标PCR应10×扩缓10ul4dNTP200umol/L10100pmolDNA0.12ugPCR术TaqDNA酶2.5uMg2+1.5mmol/L100ulPCR设计PCR应5′3′设计时DNA单链为链为5′扩5′DNA3′扩3′DNA补1.设计则1⻓长15-30bp为20bp2G+C40-60%为G+C扩G+C过现带ATGC5嘌呤嘧啶3应现补4间应补3′补5扩过70%3′连续8扩补则导扩63‘应严对选择GC75′饰酶变荧质标记码终码2.设计软PrimerPremier5.0动*Oligo6评VectorNTISuitDNAsisOmigaDNAstarPrimer3线务备1PCRDNARNA2PCR扩对标细标细细标发3标处杂质纯标样经过SDS酶K处难细酶EDTA处DNA经氯纯PCR应PCR应1.PCR应缓2.镁浓总应dNTPs浓1.5mmol/L3.浓dNTP浓20200umol/L4.TaqDNA酶2.5U(100ul4.TaqDNA酶2.5U(100ul5.浓为0.10.5umol/L6.应1变时间95℃30s2时间Tm值5℃4555℃3时间72℃1min/kb(10kb4Tm值=4(G+C)+2(A+T)7.环为2530环PCR扩产浓环达扩环环为30环过30DNA酶渐达饱产环现谓“”PCR环1.预变InitialdenaturationDNA变PCR酶对PCR议热时间试剂说书饰Taq酶时间为钟2.环变骤环95℃30DNA变缩该骤时间变时间过⻓长损酶过变彻扩败3.PrimerannealingTm值为扩⻓长调为实验础预对PCR较4.72℃进Taq酶扩⻓长较较时骤时间扩⻓长1000bpPfu设为1min/kbp5.环PCR25-40环过产扩6.环应72℃维5-15钟单链产链PCR骤1.DNA变90℃-96℃链DNA热氢键单链DNA项1.PCR应DNA污发样间污产结PCR术应临2.码护PCR仪经检查PCR仪3.过试剂“lessisusuallybetter(morespecific)”4.试剂购应这样污发丢污试剂损试剂冻dNTPs对冻5.试剂枪头涡轻弹证6.对检查污发7.对扩样8.电时DNA标PCR败带胶统败9.扩⻓长GC时产级结构时剂glycerol,formamide,NMP变glycerol稳酶DMSO级结构发过结稳应10.带动储酶冻酶时枪头酶酶应酶缓酶导酶变11.PCR产电检测时间为48h电检测48h带规则PCR应键环节1.备2.质2.25℃-65℃统DNA结链3.70℃-75℃Taq酶72℃dNTP为5′→3′补DNA链PCR检测PCR应扩⻉贝检测键荧锭EB胶电检测电检测杂误为简为检测荧针为检测渐电趋势3.酶质4.PCR环PCR⻅见问题对1.现扩带1杂质Taq酶剂质净组备时丢过变彻酶质时现扩带标处过稳处应2酶换酶酶时酶丧导Taq酶锭3质浓浓对对选单浓仅OD值琼胶电带现带应带带时PCR败应单协释时浓应浓冻⻓长导变质设计⻓长间4Mg2+浓浓过PCR扩浓过PCR扩产PCR扩败扩带5应积变进PCR扩积为20ul30ul50ul100ul应积进PCR扩临检测设;积20ul积时则败6变对PCR扩说变变时间现过扩扩过结PCR扩扩仪锅变问题7变发变结补2.现PCR扩带带时带⻬齐1设计选择扩扩2扩产污组污时应轻样枪溅酶质试剂应压样进枪头应时标应试剂线污这补扩PCR产导产PCR轻3.现扩PCR扩现带预计时现扩带扩带1补2Mg2+浓过3过4PCR环过5酶质酶现带酶则现酶过时现扩对时设计酶调换酶环93℃变wsgcc:质ppiczA电转GS115PCR筛选难题300bp现说细经细酶2.2KB带PCR还!备筛选过计变师请!胜发2005-11-17viviank:PCRP带对刚说PCR带带师诉设计发结构师说PCR谓⻅见⻅见们讨论华汇总发2006-07-1310:50sinviolet:质载PCR进扩载环ET32a还线pMD-T).环转续线这样PCR话还证认话还测总时间经济虑发2007-04-2820:42环93℃变65℃4.现带带1酶过酶质dNTP浓过Mg2+浓过过环过2对酶调换酶dNTP浓Mg2+浓环whr75:RACEPCR资invitrogen5’RACE为(Oligocapingmethod)该为规发2004-06-2917:39传说:为为总扩线虑误环试剂对实验环吗实验灭过发2012-09-0500:12aaa:PCR败标PCR1.带宽过1mm边缘⻬齐2.带3.smears现则PCR扩败应4.现带带应为发2003-02-1615:34wufujun_01:扩结带严现过问题给对1.对应进调2.3.对应时间调4.盐污5.带发2008-09-0816:00zmj0630:pcr产1.设计这这问题办2.问题3.浓过4.Taq酶Mg2+浓过5.100摄5钟块时这时应6.MIX5%5%DMSO7.PCR应进TAq酶PCR结产过⻓长时间认为TAQ酶为8.环9.带则应渐时产则虑镁浓10.发现还镁浓20-25mmol/l则虑Buffer试剂导试剂浓对11.pcr产pcr时间间话产释1001000间较⻓长释50100发2005-07-1621:05PRCPCR实时PCRPCR术电术样备PCR术SSH术应PCR术PCRPCR术标DNAPCR应备PCR术PCR应Taq酶选择PCR术PCR应产库实验术试们联们腾讯链买购乐诚7*24h购专销专卖务报录RNA电鉴(创)2005-11-17pgming2004转过PCR检测结现2012-09-04samzhang
本文标题:聚合酶链式反应(PCR)实验步骤、实验方法、实验心得
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